Age-related changes in innate immune regulation by NKT / NK cells and exacerbation mechanism in fatty liver disease

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17063
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 中寺 英介 順天堂大学, 医学部, 助教 (20596225)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: NASH / 加齢マウス / NKT細胞、NK細胞 / CD1dKOマウス / Vα14KOマウス

Outline of Annual Research Achievements

本研究では加齢によるNK細胞およびNKT細胞の相互連関を軸とした自然免疫制御の変化が脂肪性肝疾患の病態の変化にどのように関与するかを明らかにすることを目的としている。Ⅰ型NKT細胞を欠損するマウス(Vα14KO)およびⅠ型Ⅱ型のどちらも欠損するマウス(CD1dKO)と、欠損部位の異なる2種類の成熟NKT細胞ノックアウトマウスを用い、さらに若年（12週齢）に加えて高齢（58週齢）まで飼育してから実験に供し、年齢の要素も加えてNKT細胞の肝病態への影響を解析した。脂肪肝炎を惹起するために高脂肪高コレステロール食(HFHCD)を8週間投与し、通常食を投与したマウスと比較した。
HFHCDを与えたマウスでは経時的に体重が有意に増加し、増加の比率は高齢よりも若年群で顕著であった。wild、CD1dKO、Vα14KOの各群間では体重の増加に差はみられなかった。若年マウスよりも高齢マウスでより強く脂肪肝炎像を呈し、特に高齢のwildマウス群ではHFHCD摂取による有意な血清ALT値の上昇が見られた。Vα14KOマウス群ではwildマウス群よりもHFHCD摂取による血清ALT値上昇が抑制され、HFHCDを摂餌させたCD1dKOマウスではさらに有意なALT値の減少を認めた。
RT-PCRによる解析では、肝組織中のTLR4およびTNFαがHFHCD摂取によってmRNAレベルでの発現が亢進し、wildマウスと比較してVa14KOマウスとCD1D KOマウスで発現の抑制を生じたが、両KOマウス群の間には差が見られなかった。一方、IL6とCXCL2のmRNA発現はwildマウスやVα14KOマウスと比べてCD1dKOマウスで減少した。
これらの事象よりI型、II型NKT細胞は共同して脂肪肝炎の増悪に寄与していることが示され、II型NKT細胞の活性化の有無はケモカインの発現に影響した可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度では、本研究のテーマの基礎となるマウスモデルの作成を行った。欠損部位の異なる2種類の成熟NKT細胞ノックアウトマウス(CD1dKOマウス・Vα14KOマウス)をそれぞれ若年・高齢の各2群で作成し、さらにwildマウスと併せてそれぞれ通常食とHFHCDを与えたモデルを作成することができた。
さらに解析を一部すすめ、想定通りにCD1DKOマウスとVα14KOマウスがwildマウスとHFHCD投与による脂肪肝炎の発現に差があること、若年と高齢マウスでさらに病勢が異なることを確かめることができた。今後さらに採取した検体の解析をすすめていく予定だが、本年度において今後の研究の土台を確立することができ、現時点で本研究は順調に推移していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今後は肝組織のmRNAの解析をさらに進めていくと共に、蛋白レベル、酵素活性レベルでの解析を行い、各マウスモデル間における分子レベルでの病態の差異をより明らかにしていく。また、病理組織的な解析を行い、各群の肝線維化についても調べていく方針である。リンパ球サブセット解析の前段階として、肝組織中の好中球やリンパ球、マクロファージを免疫組織染色、免疫化学染色で解析し、NKT細胞の活性の相違による免疫細胞の動態の変化をより詳細に検証し、その上でフローサイトメトリーによる解析を行っていく予定である。

Causes of Carryover

病態メカニズムの解析はまだ緒を発した段階であり、今後の解析のため、RT-PCR用の試薬や免疫学的解析のための抗体、消耗品の購入が必要である。今後はフローサイトメトリーによる解析を行っていく上で、野生型マウスも含めてCD1dKOマウス・Vα14KOマウスの追加が必要であり、かつ実験用飼料の購入を要する。
さらに今後はデータを蓄積した上で学会発表および英字論文の作成を行っていく方針であり、学会参加費、旅費、論文作成、英文校正に費用を要する。