心臓線維芽細胞の新たな分子制御機構の解明と心筋梗塞における機能解析について

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17106
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小山 雄広 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (70780526)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 線維化

Outline of Annual Research Achievements

心不全は我が国で約200万人が罹患する疾患であり、高血圧、糖尿病、脂質異常症の増加に伴いその症例数は増加の一途をたどっている。心不全のうち、収縮能が低下した心不全に対しては有効な治療薬が既に開発されているが、拡張能が低下した心不全には有効な治療薬がなく、早期の治療介入を必要としている。このような拡張障害による心不全は、心筋組織における過剰な線維化を背景として発症する。心筋組織の線維化は、突然死を含めた予後不良因子であることが示唆されているが、なぜ過剰な線維化が生じるかについては未だに明らかになっていない。本研究では、心筋細胞の代謝物である乳酸が線維芽細胞を活性化するという仮説に基づき、心臓における過剰な線維化の発症機序を明らかにすることを目的とした。
Col1a1プロモーター下にGFPを発現するトランスジェニックマウス（Col1a1-GFPマウス）の心臓初代線維芽細胞を不死化することで、心臓線維芽細胞株を樹立することに成功した。この細胞株はTGF-βの刺激により、初代培養細胞と比較してより鋭敏に活性化が誘導されることを確認しており、線維芽細胞活性化におけるin vitroの有効な系を構築しえた。
さらに、ラット心筋細胞の代謝を細胞外フラックスアナライザーにより解析したところ、イソプロテレノール刺激による負荷亢進時に、解糖系へ代謝がシフトし、乳酸産生が増加することを確認することができた。また、in vivoでは、心筋梗塞モデルマウスの非梗塞部において、組織中の乳酸濃度が上昇することをイメージングマス解析により確認しえた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

in vitro, in vivoでの心筋代謝について確認できている。in vitroにおけるマウス心筋細胞のフラックスアナライザーによる代謝系の観測には、マウス心筋のランゲンドルフ灌流心実験法の樹立に時間を要したが概ね系を確立することができた。in vitroでは、心筋梗塞モデルマウスの作成を行った。心筋梗塞モデルマウスの作成にあたって、気管内挿管および左前下行枝の結紮の習得に時間を要したが安定して手技を確立することができた。

Strategy for Future Research Activity

心臓線維芽細胞株では、乳酸刺激により活性化し、Col1a1遺伝子発現が増加することを確認した。また、Col1a1遺伝子発現を活性化する因子について、プール型shRNAライブラリーを用いた網羅的解析では、HIF-1αシグナルが有意に含まれていた。
今後、乳酸が線維芽細胞においてHIF-1αを介して活性化を惹起しているとの仮説を検証する。Col1a1遺伝子のプロモーター領域には、HIF-1α 転写調節領域が含まれていることを確認した。乳酸投与により、核内でのHIF-1αタンパク量の解析、およびクロマチン免疫沈降を用いた転写調節機序の解明を行う。

Causes of Carryover

今年度は当初予定していた物品、旅費に対する費用が不要であった。次年度に必要であれば使用する。