心臓線維芽細胞の新たな分子制御機構の解明と心筋梗塞における機能解析について

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17106
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小山 雄広 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (70780526)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 線維化 / 線維芽細胞 / 心筋梗塞

Outline of Annual Research Achievements

心不全は我が国で約200万人が罹患する疾患であり、高血圧、糖尿病、脂質異常症の増加に伴いその症例数は増加の一途をたどっている。心不全のうち、収縮能が低下した心不全に対しては有効な治療薬が既に開発されているが、拡張能が低下した心不全には有効な治療薬がなく、早期の治療介入を必要としている。
拡張能が低下した心不全は間質の過剰な線維化を背景として発症することが知られている。MRIにより心臓の線維化と予後を検討した報告では、心臓線維化領域が増大するに伴い、全死亡、突然死、心不全入院が増加することが認められている。心筋組織の線維化は、突然死を含めた予後不良因子であることが示唆されているが、なぜ過剰な線維化が生じるかについては未だに明らかになっていない。
Col1a1プロモーター下にGFPを発現するトランスジェニックマウス（Col1a1-GFPマウス）の心臓初代線維芽細胞を不死化することで、心臓線維芽細胞株を樹立することに成功した。この細胞株はTGF-βを含めた線維化を誘導する刺激により、初代培養細胞と比較してより鋭敏に活性化が誘導されることを確認している。
高負荷時の心筋細胞が産生する乳酸により、正常心筋組織の心臓線維芽細胞株が活性化しCol1a1産生が亢進することを確認している。本研究では、心筋細胞の代謝物である乳酸が線維芽細胞を活性化するという仮説に基づき、心臓における過剰な線維化の発症機序を明らかにすることを目的とする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

心筋梗塞モデルマウスでは、心筋梗塞後の非梗塞部において、組織中の乳酸濃度が上昇することをイメージングマス解析により既に確認している。組織内低酸素による心筋細胞内の代謝を介した機序を想定しており、解糖系代謝阻害薬である2-DGを用いて心筋細胞における代謝シフトが起きる機序の解明に取り組んでいる。
また、樹立した線維芽細胞株を乳酸により刺激するとCol1a1遺伝子発現が増加し、心臓線維芽細胞が乳酸により活性化することを確認している。樹立した心臓線維芽細胞株のCol1a1遺伝子発現を活性化する因子について、プール型shRNAライブラリーを用いた網羅的解析を行ったとろ、既知のTGF-βシグナルに加えてHIF-1αシグナルが有意に含まれていた。実際に、in vitroにおいて乳酸投与により、心臓線維芽細胞核内でのHIF-1αタンパク量が増加する知見を得ている。これらの結果から、心臓細胞由来の乳酸が心筋線維芽細胞において核内のHIF-1αを誘導することで、Col1a1遺伝子発現を促す仮説を検証している。乳酸が核内HIF-1αを誘導する機序については、13C炭素同位体によりラベルされた乳酸を用いて、線維芽細胞内の代謝物質の変化によるPHD阻害とHIF-1α誘導との関連をフラックス解析を行っている。乳酸によるROSを介したHIF-1αの誘導が示唆されており、線維芽細胞株においてH2DCFDAを用いた細胞内ROS測定を行う。

Strategy for Future Research Activity

組織内低酸素による心筋細胞内の代謝を介した機序を想定しており、解糖系代謝阻害薬である2-DGを用いて心筋細胞における代謝シフトが起きる機序の解明に取り組んでいる。
心臓細胞由来の乳酸が心筋線維芽細胞において核内のHIF-1αを誘導することで、Col1a1遺伝子発現を促す仮説を検証している。乳酸が核内HIF-1αを誘導する機序については、13C炭素同位体によりラベルされた乳酸を用いて、線維芽細胞内の代謝物質の変化によるPHD阻害とHIF-1α誘導との関連をフラックス解析を行う。乳酸によるROSを介したHIF-1αの誘導が示唆されており、線維芽細胞株においてH2DCFDAを用いた細胞内ROS測定を行う。
HIF-1αにはoxygen-dependent degradation（ODD）ドメインがあり、ドメイン内の二つのプロリン残基が、PHDにより水酸化される。この水酸化されたプロリン残基が von Hippel-Lindau タンパク質（pVHL）によってユビキチン化されることにより、プロテアソーム依存的に速やかに分解される。ODDドメインへの乳酸の集積がPHDによる水酸化を阻害していることも想定され、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タグ融合HIF-1αを用いて乳酸とHIF-1αとの相互作用について検証する。

Causes of Carryover

次年度に試薬、解析機器の購入を検討している。