CCR2特異的新規PETトレーサーを用いた動脈硬化の病態解明およびその臨床応用

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17115
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 馬場 理 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (30758446)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 動脈硬化 / ケモカイン受容体 / CCR2 / PET

Outline of Annual Research Achievements

動脈硬化性疾患において、不安定プラークの同定を可能とする診断方法、および動脈硬化巣における分子動態を非侵襲的に評価する方法の開発が求められているが、PET検査は潜在的にそれらを可能とする。ケモカイン受容体の一つであるCCR2は主に白血球表面に発現しており、動脈硬化進展において重要な役割を果たしていることが判明している。これらを鑑みて、我々のグループではCCR2に特異的に結合するPETトレーサー(64Cu-DOTA-ECL1i)を開発した。また、我々は、このトレーサーがマウスにおける動脈硬化巣に集積することを明らかにしている。本研究においては、このトレーサーの動脈硬化巣におけるPETシグナルの病的意義、および標的細胞を明らかにすることを目的としている。これまでに、(1) 動脈硬化巣におけるCCR2陽性細胞は主に非泡沫性炎症性マクロファージであること、(2) 蛍光色素にて標識したCCR2特異的トレーサー(CF640R-ECL1i)を用いて、その体内での分布を解析したところ、末梢血では炎症性単球に主に結合し、動脈硬化巣では単球およびCCR2陽性マクロファージと結合すること、(3) マウス動脈硬化退縮モデルにて大動脈中のCCR2陽性白血球分画について解析したところ、単球およびCCR2陽性マクロファージ含有量の有意な低下が認められ、それに伴いCCR2特異的PETシグナルが低下していることが判明した。今回、それに加えて、(1) CCR2陽性マクロファージの起源についてadoptive transfer法を用いて解析を行ったところ、末梢血中の単球であることが判明してきた。また、(2) LDL受容体欠損マウスを用いた早期プラークモデルにおいても大動脈中のCCR2陽性細胞の増加および大動脈弓におけるPETシグナルの増加が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、当該年度の計画として予定されていた、早期プラークモデルにおけるPETシグナルの解析については、予定通り開始はしているものの、コロナ蔓延の影響もあり遅延傾向であり、実験の継続を必要とする。また、CCR2陽性マクロファージ起源探索を目的としたAdoptive transfer法についても、必要なマウスであるAyu1 Cre:Rosa26 TdTマウスの作成にやや時間がかかったこと、さらに実験に必要な数の単球を得るために予想より多い数のマウスが必要であったことから、現在、ようやく予備実験が終了した段階である。ただし、予備実験ながら、Ayu1 Cre:Rosa26 TdTマウスから採取し、アポE欠損マウスに投与したTdT陽性単球の動脈硬化巣での検出には成功しており、その大部分がCCR2陽性マクロファージに分化すること、しかしながら一部は泡沫細胞に分化し得ることが判明した。そして、研究の質をより高めるためには、Adoptive transfer法の結果を、別の実験手技を用いて確認することが良いと思われた。このために、マウス同士を接合して体循環を共有するParabiosis法が望ましいと考えられた。このために、Parabiosis法を習得するとともに、実験に必要なマウスであるLysMCre:Rosa26-TdT:LDLr KOマウスマウスの作成を行っている。一方、CX3CR1CreERT2:Rosa26-TdT:LDLr KOマウスにタモキシフェンを投与して、大動脈在来性マクロファージ分画をTdT陽性とし、その後、動脈硬化形成を促したが、その大動脈在来性マクロファージ分画はCCR2陽性マクロファージとはならないことが示唆された。こちらの実験についてもサンプル数が少ないためにさらに実験を継続する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通り、早期プラークモデルを用いたCCR2特異的PETトレーサーの動脈硬化発症予測能の評価について継続していく。そして、予備実験ながら新たな知見を得ることができたAdoptive transfer法による動脈硬化巣中の末梢血単球由来のマクロファージ分画の解析を継続して行っていく。さらに、その確認としてParabiosis法を用いた末梢血単球由来のマクロファージ分画の解析も行う。具体的には、LysMCre:Rosa26-TdT:LDLr KOマウスをLDLr KOマウスと接合してLDLr KOマウス側の動脈硬化巣のマクロファージ分画を解析する。LysM Cre: Losa26 TdT: LDLr KOマウスを用いたLineage tracing法についても継続して実験を行っていき、大動脈在来性マクロファージ分画が動脈硬化巣中のどのようなマクロファージ分画に分化していくのかを経時的に解析していく。また、今後は、動脈硬化巣中の各マクロファージ分画が動脈硬化形成、進展にどのように寄与しているのかを解析していく予定である。具体的には、CD11cCre-iDTRおよびCCR2CreERT2-iDTRマウスを用いて、動脈硬化巣中のCD11c陽性泡沫細胞、CCR2陽性炎症性マクロファージを除去することによって動脈硬化形成への影響を評価する。これにより、今後の動脈硬化治療、予防において各マクロファージ分画にどのようにアプローチすれば良いのかの指針を得ることができると考える。

Causes of Carryover

当該年度の研究が、事前予測より遅延したために使用額が小さくなった。また、事前に予定されていたものとは別の追加実験（Parabiosis法を用いた末梢血単球由来の動脈硬化巣中マクロファージ分画の解析）の必要性が生じたために、これについても繰越金を使用する予定である。