2020 Fiscal Year Research-status Report

Targeting of Numb-EphB3/4 molecular interaction and elucidation of signaling mechanism in pulmonary fibrosis

Research Project

Project/Area Number	20K17179
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	松井利憲名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (80839861)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2022-03-31
Keywords	特発性肺線維症 / 肺線維化 / シグナル伝達 / 分子機構 / 抗線維化薬
Outline of Annual Research Achievements	特発性肺線維症(IPF)は、慢性進行性の不可逆な線維化病変を形成し、高度な呼吸機能低下を呈して死に至る予後不良な疾患である。肺の線維化病変形成時の線維芽細胞の増殖・遊走や筋線維芽細胞への分化を制御する分子機構を解明することが、IPF進行を抑制する抗線維化薬の創成へつながる。近年、Ephrin/Eph受容体のシグナル経路が治療標的として注目されている。本研究では、シグナル制御因子Numbが、EphB3/4に結合しEphrin/Eph受容体シグナル経路を制御して肺線維化を促進すると仮説を立て、IPF進行の病態解明と抗線維化薬創成の分子基盤の構築を目的とした。 NumbがEphB3/4を細胞膜上で安定化させEphrin/Eph線維化シグナルを促進すると仮説を立て、分子、細胞、個体のレベルで階層的かつ有機的に研究を進めている。分子レベルではPulldown assayを用いてNumbのPTB (phosphotyrosine-binding)ドメインがEphB3/4の細胞質領域と結合することを見出した。EphB3/4のdeletion mutantを作製し、より狭域の結合の責任領域の同定を試みたが特定できず、Numb-PTBをNumb-EphB3/4結合を特異的に阻害するdominant negative mutantとして使用する方針とした。肺線維化におけるNumb-EphB3/4結合の意義を個体レベルで解析するため、Bleomycin (BLM)による肺線維化モデルマウスの実験系を立ち上げた。さらに、アデノ随伴ウイルス（AAV-DJ）を経気管支投与し個体内の肺組織における分子発現とKnock Downをする実験系を現在確立しつつある。Numb-PTBを肺組織で強発現させたのちにBLMで肺の線維化を評価する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 勤務環境面での遅延の理由としては、小官は名古屋大学附属病院の病院助教として呼吸器内科臨床にも勤務しており、2020年1月頃からの新型コロナウイルス感染の蔓延・拡大に伴う臨床業務の増加により十分な時間の確保が難しかったことが挙げられる。研究進捗の遅延の理由としては、①Eph受容体におけるNumb結合領域をアミノ酸配列まで同定しようとしたが同定できなかったことがある。②個体レベルの解析で、BLM並びにAAVの経気管支投与において安定的な投与方法の構築に時間を要したことが挙げられる。
Strategy for Future Research Activity	勤務環境面での遅延理由に対しては臨床業務の効率化を図る。また今後の新型コロナウイルスの沈静化に期待する。研究進捗面での遅延理由に対して、上記での①に対しては、次善の方法としてNumb側の結合領域でdominant negative mutantを作成し細胞・個体レベルでの研究につなげていく。②に対しては、後々の肺繊維化評価のために経気管支投与法の再現性と安定性は必須であると思われ、ある程度時間をかけても克服すべきと考える。前者はさまざまな機器の利用で克服しつつあり後者の取り掛かっている。全体的な遅延に対しては、研究結果としての意義の大きい個体レベルでの研究を先行し研究の核となる研究結果を得ることに努める。その後、細胞生物学的手法を駆使してのNumb-EphBの分子作用機序や生理機構などの詳細を明らかにする予定である。
Causes of Carryover	2020年度は新型コロナウイルス肺炎の蔓延に伴い研究時間が大幅に制限されて研究が遅延したことで計画していた研究費が想定よりも大幅に減り、次年度使用が生じた。今後、進捗を取り戻し研究を進めていく上で本来2020年度に使用を予定していた用途にて2021年度にて研究費を使用する予定である。