肺線維化病態における血漿中ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡの探索研究

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17199
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 猪俣 稔 日本医科大学, 大学院医学研究科, 研究生 (50465291)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 特発性肺線維症 / cell free DNA / C57BL/6マウス / ブレオマイシン

Outline of Annual Research Achievements

Human foetal lung fibroblast(HFL-1)においてSYBR Gold(Thermo Fisher Scientific)を用いてcfDNAの定量解析を行った。HFL-1の培養液中cfDNAは606.7 ng/mLであり、TGF-β 10 ng/mL投与後の培養液中cDNAは1179.4 ng/mLまで上昇し、TGF-β刺激によりcfDNAが上昇することが確認された。C57BL/6マウスにブレオマイシン（BLM）をosmotic pumpで100mg/kg投与しBLM誘発肺線維症モデルマウスを作製した。BLM投与後1週間のマウスに加え、BLM非投与マウス(normal control：NC)をそれぞれサクリファイスし、採取した血液を2000×g、10分間で遠心分離し血清を採取した。NucleoSpin cfDNA XSを用いて血清からcell free DNA(cdDNA)を抽出した。その後Quanti-iTTM ds DNA Assay kit、SYBR Goldを用いてcfDNAを定量した。cfDNA中央値（最大値-最小値）はNC群で327.7 (96.5-388.3) ng/μL、BLM群で1448.1 (1084.6-2503.8) ng/μLとBLM群で上昇していた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初の計画はコロナ禍のため遅れている。
研究計画では、2020年度の予定は、cfDNAをHFL-1に投与し細胞培養液中のα-SMA、collagen type IをRT-PCRで解析し、cfDNAによるprofibrotic responseを解析する予定であったが、実験計画が遅れているためBLM、osmotic pumpを用いて作成した肺線維症モデルマウスを用いて血中のcfDNAを測定した。

Strategy for Future Research Activity

これまで同様、肺線維症モデルマウスでcfDNAの解析を進める。BLM投与後7, 14, 21, 28日目に末梢血を採取しcfDNAを定量・単離し、同cfDNAを経静脈的に再び投与し、投与後7、14、21、28日目に肺線維化をashcroft score、collagen assayを用いて解析することで、cfDNAの肺線維化病態への関与を確認する。また、末梢血の採取と同時に肺を採取・培養し、細胞培養液中のcfDNAの定量解析を行う。さらに同細胞培養液中から単離したcfDNAを肺培養細胞に投与し、α-SMAやcollagen type I の発現をRT-PCRで解析することでprofibrotic responseを確認する。

Causes of Carryover

COVID-19の影響で実験計画に遅れが生じたため次年度使用額が生じたが、今後の予定としてはこれまで同様、肺線維症モデルマウスでcfDNAの解析を進める。BLM投与後7, 14, 21, 28日目に末梢血を採取しcfDNAを定量・単離し、同cfDNAを経静脈的に再び投与し、投与後7、14、21、28日目に肺線維化をashcroft score、collagen assayを用いて解析することで、cfDNAの肺線維化病態への関与を確認する。また、末梢血の採取と同時に肺を採取・培養し、細胞培養液中のcfDNAの定量解析を行う。さらに同細胞培養液中から単離したcfDNAを肺培養細胞に投与し、α-SMAやcollagen type I の発現をRT-PCRで解析することでprofibrotic responseを確認する。