特発性肺線維症の肺線維芽細胞に対する新規BET阻害剤の抗線維化作用の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17226
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 金丸 良太 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (70869156)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 間質性肺炎 / 肺線維症 / BRD4

Outline of Annual Research Achievements

近年、新たな創薬のターゲットとしてエヒシェネティック機構が注目されており,　特にBET(Bromodomain and Extra- Terminal)蛋白質は線維化との関連性が示唆されている.　本研究では特発性肺線維症における肺線維化のメカニズムを解明し,　抗線維化作用を有する新規薬剤の創薬につながる研究 を行う事を目的とする.　我々は次世代の抗線維化薬として新規BET(BRD4)阻害剤OTX015の可能性に着目した. 正常肺より採取した線維芽細胞を用いて,　TGFβ1により刺激した細胞とTGFβ1刺激及びOTX015を投与した細胞よりRNAを抽出,　マイクロアレイ解析を行い,　両者を比較したところ,　NOX4等の数多くの発現変動遺伝子が挙げられた.　 我々は胎児肺由来線維芽細胞を用いた生理機能活性解析（コラーゲンゲルコントラクションアッセイ,　ケモタキシスアッセイ）を行い,　TGFβ1投与下/非投与下で,　NOX4阻害薬によるコラーゲンゲル収縮抑制及び遊走能が抑制されることを証明した.　また同細胞を用いたウエスタンブロット法によるタンパク発現解析により,　TGFβ1刺激で発現亢進したFibronectinやα-smooth muscle actinは,　OTX015,　及びNOX4阻害薬を投与することにより両者とも優位に抑制された.　またブレオマイシン肺線維症モデルマウスにおいても,　NOX4阻害薬投与により肺線維化(Ashcroft score)が優位に抑制されることを証明した.　以上よりNOX4阻害薬は抗線維化作用を有している可能性がある.　またNOX4以外のBRD4が転写に関与する因子についても検証していく.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

BRD4阻害薬(OTX015)及びBRD4 が転写に関与するNOX4の阻害薬による胎児肺由来線維芽細胞を用いた生理機能活性及びブレオマイシン肺線維症モデルマウスにおいても線維化抑制効果は証明された.　OTX015によりNOX4の発現抑制及び酸化ストレス産物が抑制されることの検証が必要である.　さらにNOX4以外でBRD4が転写に関与する因子についても同様に検証していく予定である.

Strategy for Future Research Activity

ウエスタンブロット法によりOTX015がNOX4発現を抑制,　酸化ストレス産物も抑制することを証明する.　またブレオマイシン肺線維症モデルマウスにおいて,　BRD4阻害薬及びNOX4阻害薬投与により,　気管支肺胞洗浄液のELISA及びウエスタンブロット法,　血清ELISA,　肺組織の免疫組織化学染色を評価する.　また前記のマイクロアレイ結果を参考にNOX4以外のBRD4が転写に関わるシグナルについても同様に解明していく.

Causes of Carryover

今後の計画は【今後の研究の推進方策】で述べた通りであるが,　BRD4がNOX4の転写に関与しており,　酸化ストレスを介して線維化を生じていることの証明が必要であり,　ウエスタンブロット法,　ELISA,　免疫蛍光染色,　免疫組織化学染色等を用いて,　検証していくため,　次年度使用額が生じている.　またNOX4以外のBRD4が転写に関わるシグナルについても生理機能活性解析やウエスタンブロット,　ELISA等で評価する予定であり,　実験費用が必要である.　さらにBRD4阻害,　NOX4阻害によりin vivo,　in vitroにおいて抗線維化効果を示しているのは事実であり,　これらのデータは論文化の予定であり,　投稿費用も必要である.