2022 Fiscal Year Research-status Report
先天性腎尿崩症の治療法探索のためのアデニル酸シクラーゼとGsαの構造解析
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20K17245
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
野村 莉紗 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特任助教 (70868124)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ADCY6 / 腎性尿崩症 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / ADCY9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は以前よりアクアポリン4(AQP4)の構造解析の実績を有していたことなどからAQP2に注目し、腎臓の水の再吸収の系であるバソプレシン受容体(V2R)からADCY6, PKA/AKAP, AQP2のシグナル系にあるタンパク質の構造解析を目指してきた。この系の異常として腎性尿崩症という疾患が知られている。腎性尿崩症は腎臓の水分再吸収がうまくいかず尿量が非常に増えてしまう疾患で、先天性のものの場合新生児期に脱水などにより脳の障害を伴ったり、成長後も多量の尿が産生されることにより腎尿路系の異常をきたし、またその尿量は1日10-20Lにまで及ぶこともあり1－2時間おきに排尿をしないとならずQOLが著しく損なわれる疾患である。現在までに根本的な治療方法はなく、疾患のコントロールは難渋する。我々は腎性尿崩症の根本的な治療法を模索するべくV2RからAQP2までのシグナル上のタンパク質の構造解析を目指しており、本研究ではADCY6の構造解析を目指している。
生物の細胞の、創薬のターゲットとなりうるGタンパク質共役型受容体(GPCR)は受容体にリガンドが結合するとGs,Gα、Gβ/γが外れてアデニル酸シクラーゼ(ADCY)と結合し細胞内にシグナル伝達がなされる。ADCYは0-9までの型があり、広く全身の細胞に発現している。腎臓の集合管においては前述した通りADCY6が主に発現している。ADCYの構造解析においては2019年にbovineのADCY9の単粒子解析の報告がなされ、2023年にbovineのADCY8の単粒子解析の報告がなされたが、ADCY6に関しては報告がない。我々はまず、ヒトのADCY9の発現精製と単粒子解析を行い、その知見を得てヒトADCY6の発現精製と単粒子解析を目指すこととした。HEK293系のExpi293細胞にヒトADCYのバキュロウイルスを感染させ細胞を回収し、精製を行い、クライオ電子顕微鏡を用いて単粒子解析を行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ヒトADCY9の発現精製は可能となり、単粒子解析も進んでいる。ADCY6に関してはヒト以外にもイヌ、ゴリラ、マウスなどいくつかの生物種も用いて発現させたが、発現量が低い上に安定性が低く分解されてしまうため構造解析に持ち込むのが難しい状況である。
また、研究責任者が2022年度に産休に入っていたため研究が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトADCY6の発現量の向上、安定性の向上を得るために、アルファタグとnanobody(Nb)の活用、およびpeptidiscの活用などを検討している。まずは安定して得られるようになったヒトADCY9の一部を改変しαタグをいれ、ADCY9と結合するGsαにnanobodyを入れて結合をより強固にした状態で共発現をすることで発現量や安定性が向上するか、そしてpeptidiscを使用した場合の解析などを行い、上記を使わなかったときのADCY9の解析と差異がなかったかをまずは検討する。
差異がなかったら、ヒトADCY6にもαタグを挿入しNb-Gsa,Nb-Giとの共発現をして安定性を上げて精製する。また、peptidiscなどを使うことで安定性が向上するかなども見てみる。
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| Causes of Carryover |
2022年度に産休に入り研究が一時停止していたため。
今年度の使用計画としては、αタグ入りのペプチドを作成するためのプラスミド作成費、細胞培養の培地の購入やpeptidisc、digitoninなどのdetergent購入費窓に使用する予定です。
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Research Products
(1 results)
