尿中落下細胞に含まれる多能性幹細胞の同定と解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17272
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 内田 奈生 東北大学, 大学病院, 助教 (30771670)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 尿中落下細胞 / 多能性幹細胞 / SSEA-3 / 再生医療 / 細胞塊

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、腎疾患患者の尿中落下細胞の中の幹細胞を同定し、将来的な再生医療への応用につなげること想定したものである。本研究計画で設定した項目に従って、進捗状況を記載する。
①尿中落下細胞内の尿幹細胞の同定：IgA腎症やAlport症候群、紫斑病性腎炎の患者から尿の提供を受け、尿中落下細胞を培養した。Oct4、Nanog、Stage specific embryonic antigen 3(SSEA-3)の3種類の幹細胞マーカーで免疫染色を行った。培養細胞中にES細胞様の細胞塊が出現し、アルカリフォスファターゼ染色陽性であり未分化性が保たれていると考えられた。また他の細胞塊はSSEA-3陽性であった。本細胞塊がES細胞のように多能性を持つ可能性を考え、細胞塊を分離し、RNA抽出を行った。次年度はOct4やNANOGなどの多能性マーカーについて発現をqPCRで確認する予定である。
②尿幹細胞の患者腎組織における局在：①のように腎疾患患者の尿中に含まれる幹細胞マーカーとしてSSEA-3が有用と考えられた。次年度は尿の提供を受けた腎疾患患者の腎生検標本上で、SSEA-3陽性細胞の局在を免疫染色で確認する予定である。
③尿幹細胞の性質；間葉系組織（骨、軟骨、脂肪）への分化能、多能性の有無：次年度は細胞塊をトリプシン処理し、二次元培養で細胞を増殖させることを試みる。そこからの分化誘導などにより、多分化能を検証する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上記のごとく、尿中落下細胞を複数の腎疾患患者の尿から得ることができ、幹細胞のマーカーとなりうる候補が絞られた。ALP陽性の細胞塊について、多能性を持つ構造物と推定し、その検証をPCRや接着培養からの分化の確認等で行いたいと考えている。2020-2021年度の研究成果により、2022年度の研究の方針・手法が定まった。今年度、速やかに実験を実施し、検証を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

①尿中落下細胞内の尿幹細胞の同定：SSEA-3を幹細胞マーカーとして用で染色を行った。SSEA-3陽性細胞をFACSで単離できれば、単離した細胞のqPCRでの多能性マーカーの発現の確認を行う。また浮遊培養による自己増殖能の確認や、接着培養を分化誘導し多分化能の検証を行う。しかし、尿中落下細胞をFACSにかけた際には細胞の大小不同や状態不良によりFACSでの解析が困難であった。解析時期を変えるなどの工夫をして再度試みる。また、培養細胞中に出現するALP陽性の細胞塊を単離し、qPCRや接着培養・分化誘導等により多能性の検証を行う。
②幹細胞の患者腎組織における局在：尿の提供を受けた腎疾患患者の腎生検標本上で、SSEA-3陽性細胞の局在を免疫染色で確認する。
③尿幹細胞の性質；間葉系組織（骨、軟骨、脂肪）への分化能、多能性の有無：細胞塊をトリプシン処理し、二次元培養で細胞を増殖させることを試みる。そこからの分化誘導などにより、多分化能を検証する。

Causes of Carryover

幹細胞マーカーの同定に時間がかかったため、研究の進捗がやや遅れたことと、学会がweb開催であったため、旅費がかからなかったことによる。