2020 Fiscal Year Research-status Report
A development of a gene mutations-targeted novel therapy in malignant lymphoma
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20K17409
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
川井 英嗣 東海大学, 医学部, 助教 (70749944)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | UTX / STK3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
COMPASS複合体を形成するKMT2D、CREBBP、UTXに対する合成致死遺伝子を同定し、治療につなげることが本研究の目的である。KMT2D、CREBBP変異は悪性リンパ腫の一部、UTX変異は多発性骨髄腫一部にみられる。悪性リンパ腫または多発性骨髄腫細胞株にcas9を発現させた後、各遺伝子のノックアウト細胞(KO)を作成した。CRISPR/Cas9系を利用し、19000以上の遺伝子を網羅するレンチウイルスライブラリーを野生型およびKO型に感染させた。DNAを回収し、次世代シーケンサーを用いて解析し、リード数を比較した。UTXについて、野生型では変化がなく、KO型のみで減少する遺伝子を合成致死遺伝子の候補として267遺伝子をピックアップした。さらにRNAシーケンスを行い、KO型でよりリード数が高い遺伝子が治療標的となりやすいと考え、73遺伝子をピックアップした。阻害剤がある遺伝子を選び、実際に阻害剤のIC50を比較した。複数の阻害剤を調べたところ、野生型よりKO型で有意に効果のあるものとして、STK3阻害剤があげられた。STK3阻害剤投与後、KO型のIC50は野生型と比較し低く、細胞増殖は抑制された。さらに、STK3のsgRNAをGFPベクターにいれ、ウイルス液を作成し、感染させると、FACS解析にて、KO細胞のみでGFP陽性率が低下した。このことからUTXの合成致死遺伝子として、STK3が有力である。KMT2Dに対する合成致死遺伝子の同定では、KMT2D野生型またはKO型で、効果に違いのある阻害剤はまだ見つけられていない。次世代シーケンサーの解析のところで、回収したDNAを可能な限り全量解析し、より強固なデータにすることで、効果に違いのある阻害剤の発見に結び付けたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UTXの合成致死遺伝子の候補として、STK3をあげることができた。一方、KMT2Dについては、次世代シーケンサーの結果は出て、候補遺伝子は複数あげられたが、残念ながら、UTX野生型とKO型でIC50に差のある阻害剤はみつけられなかった。回収したDNAの一部を次世代シーケンサーで解析していたが、そのDNAを可能な限り全量解析することし、より正確なデータとなる。その上で、候補遺伝子を抽出し、阻害剤があるものを試していく予定である。ただし、UTXについてはSTK3阻害剤がUTXKO型に効果があることは固まった事実であり、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivoにてSTK3阻害剤の有効性を証明し、さらにメカニズム解析に進みたい。in vivoでは、免疫不全マウスを用い、多発性骨髄腫細胞株のAMO-1にUTX野生型またはKO型を導入した細胞を用意する。さらに、IVISで評価するため、あらかじめAkulucウイルスを感染させた、ソーティングした細胞を用意した。これらを免疫不全マウスに静注する。腫瘍生着はIVISで評価し、その後STK3阻害剤を系腹腔的に投与し、その薬剤効果をIVISで判定する。
一方、なぜSTK3阻害剤がUTXKO型に効果があるのか、メカニズム解析を進めたい。リン酸化マッピングを行い、キナーゼのリン酸化に違いがあるのかどうか解析したい。
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| Causes of Carryover |
各学会が中止またはオンライン開催になったことで、旅費が不要となった。また、人件費・謝金の部分で、英語論文校閲費を予備として予定していたが、学会発表や論文発表がなく、繰り越しとなった。その他の部分は、主に動物飼育費を想定していたが、使用しなかった。これまでの結果より次年度に動物実験を行う目途が立ち、動物飼育費や、IVISなど実験機器の使用費、投与する薬剤費等に繰越金を使用する予定である。
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