A development of a gene mutations-targeted novel therapy in malignant lymphoma

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17409
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 川井 英嗣 東海大学, 医学部, 助教 (70749944)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: UTX / STK3 / KMT2D

Outline of Annual Research Achievements

COMPASS複合体を形成するKMT2D、CREBBP、UTXに対する合成致死遺伝子を同定し、治療につなげることが本研究の目的である。悪性リンパ腫または多発性骨髄腫細胞株にcas9を発現させた後、各遺伝子のノックアウト細胞(KO)を作成した。CRISPR/Cas9系を利用し、19000以上の遺伝子を網羅するレンチウイルスライブラリーを野生型およびKO型に感染させた。DNAを回収し、次世代シーケンサーを用いて解析し、リード数を比較した。RNAシーケンスの結果を合わせ、73遺伝子をピックアップした。阻害剤がある遺伝子を選び、実際に阻害剤のIC50を比較した。UTX野生型よりKO型で有意に効果のあるものとして、STK3阻害剤があげられた。in vitroでの薬剤感受性、細胞増殖をみる実験から、STK3阻害剤を暴露させると、UTX-KO型でより効果が表れた。in vivoにおいて、Akalucを感染させたUTX-WT型、UTX-KO型の細胞をNOGマウスに移植し、それぞれvehicle投与群、STK3阻害剤投与群に分け2週間の投与を行った。生存曲線、およびIVISによる腫瘍量の比較を行った。WT型では有意差はなかった。KO型では、STK3阻害剤を投与すると、生存曲線は、vehicle群40日に対し、STK3阻害剤群46日に延長した。また、IVISにおける腫瘍量の比較も、移植後4週、5週の時点で、STK3阻害剤投与群で有意に腫瘍は縮小した。in vivoにおいても、UTX-KO型でSTK3阻害剤の効果が高いことを証明した。
KMT2Dについては、上記同様の方法で、DNAスクリーニングとRNAシーケンスの結果より、279遺伝子をピックアップでき、さらに阻害剤がある5つの遺伝子につき、KMT2D-WT型と、KO型において、阻害剤のIC50を比較している最中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

UTXの合成致死遺伝子の候補として、STK3をあげることができた。STK3阻害剤がUTX-KO型に効果があることは、in vitroに加え、in vivoでも確認できた。おおむね順調に進展していると考えている。
KMT2Dについても、候補遺伝子は絞り込むことができ、現在IC50の比較中で、候補が定まればさらに発展させることができる。

Strategy for Future Research Activity

UTXについては、STK3のsgRNAをもとにウイルスを作成し、感染実験を行う。UTXをKOした時の増殖曲線を比較する。それによりUTX-KO型のみでSTK3 sgRNAを入れると、増殖が抑えられれば、UTXの合成致死遺伝子は、STK3であることを証明する確定的なデータとなる。
一方、なぜSTK3阻害剤がUTX-KO型に効果があるのか、メカニズム解析を進めたい。リン酸化マッピングを行い、キナーゼのリン酸化に違いがあるのかどうか解析したい。
KMT2Dについては、WT型とKO型で、阻害剤で差が出るものがあれば、その遺伝子の阻害剤のin vitroでの実験を続け、データを固めたい。in vitroで十分な差があれば、UTX同様、in vivoでもその阻害剤の効果を確認していきたい。

Causes of Carryover

学会がオンライン開催になったことで、旅費が不要となった。また、人件費・謝金の部分で、英語論文校閲費を予備として予定していたが、学会発表や論文発表がなく、繰り越しとなった。これまでの結果より次年度に、vitroで使用する試薬や消耗品、動物実験に関する動物飼育費や、IVISなど実験機器の使用費、投与する薬剤費等に繰越金を使用する予定である。