スタチンによる骨格筋障害発症機序とコレステロール代謝の骨格筋形成特有な役割の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17483
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 大崎 芳典 筑波大学, 医学医療系, 講師 (10844821)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: HMG-CoA還元酵素 / HMGCR / スタチン / 横紋筋融解症 / 骨格筋 / ミオパチー / Rab

Outline of Annual Research Achievements

2021年度は引き続き前年度に作成したATPバイオセンサーを組み込み，かつ，Rosa26もしくはHMGCRをKOしたcell-lineを使用し，各種Rab small G proteinのsiRNAを作用させ，対照群であるRosa26-KO群とHMGCR-KO群で筋線維のATP含有量の有意差が小さくなるRab small G proteinのスクリーニングを進めていた．
スクリーニング陽性のRab small G proteinを１つ検出したものの，実験をすすめる途中でC2C12の分化培地に使用するHorse Serumのロット変更に伴いATPバイオセンサーの挙動が変化しており，従来の方法でスクリーニングを効率的に進める事が難しくなった．
このため，スクリーニング方法の変更を検討する必要性が生じ，最終的にNikonの顕微鏡を用いた核のdigital stainによる，生細胞の核数の比較を元にしたスクリーニングの系への変更を行った．新たな系でスクリーニングを実施し，対象のRabの1/2程度が完了した時点で2つのスクリーニング陽性Rab small G proteinを検出している．
また，スクリーニングで陽性となったRab small G proteinが検出されたため，スクリーニングと並行して，in vitroでRab small G proteinの蛋白産生とプレニル化処置を行い，エレクトロポレーションにより蛋白質を細胞に導入し，機能させる実験系の条件検討を行っている．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Covid-19の流行に伴い，所属機関の業務範囲内において，Covid-19関連の診療や業務に従事する必要が散発的に発生していることと，上述のとおりスクリーニング系の変更に伴い，当初の予定より4.0ヶ月程度の研究業務の遂行遅延が発生していると判断する．

Strategy for Future Research Activity

2022年度は上述のRab small-G proteinのsiRNAライブラリによるスクリーニングの完了と，検出されたRab small G proteinに対して，in vitroではプレニル化処置を行ったRab蛋白の導入で，in vivoではRabに対するshRNAを発現するAAVの局所筋注で，それぞれHMGCRをKOした細胞や骨格筋の障害を軽減できることを確認することを第一とする．
その後，当該Rab small-G proteinのノックアウト（もしくはノックダウン）マウスを作成し，骨格筋特異的HMGCRノックアウトマウスとかけあわせえることで，その筋障害が改善することを確認する．あわせて，細胞内小胞輸送のどの部分の障害が筋障害，ひいては骨格筋の維持に重要かを明らかにしていく．