糖毒性・脂肪毒性による分泌顆粒内におけるプロインスリンプロセシング障害の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17501
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 飯田 雅 順天堂大学, 医学部, 准教授 (60751146)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: インスリン / プロインスリン / 糖尿病 / PC1/3 / PC2

Outline of Annual Research Achievements

血中プロインスリン/インスリン比は臨床で測定可能な膵β細胞機能の指標の一つであり、2型糖尿病発症以前の耐糖能異常の段階から上昇を来す。プロインスリンプロセシングは膵β細胞分泌顆粒内においてProhormone Convertase 1/3(PC1/3)及び2(PC2)が中心的に作用するため、血中プロインスリンの上昇はこれらの酵素機能の障害を示唆する。PC1/3とPC2は共に前駆体として生成され、その成熟と酵素活性は共に分泌顆粒内酸性環境とカルシウムに依存するため、酵素機能障害は分泌顆粒内環境の変化を反映する。本研究は2型糖尿病発症に関与する糖毒性、脂肪毒性がプロインスリンプロセシングに及ぼす影響を、プロセシングエンザイムであるPC1/3とPC2の酵素機能障害の観点から明らかにすることを目的とする。
C57BL/6マウスから単離した膵島と膵β細胞系腫瘍株であるMIN6細胞に高濃度グルコース及び飽和脂肪酸を負荷し，ウエスタンブロット法でインスリンとプロセシングエンザイムのそれぞれの未成熟体と成熟体の比を確認し、糖毒性、脂肪毒性によるプロインスリンプロセシングの障害を検証した。これらの刺激によりプロセシングエンザイムの成熟が障害され、プロインスリンプロセシングが障害されたことを確認した。次に電子顕微鏡による形態学的検討では、プロインスリンの蓄積を示唆する未成熟分泌顆粒の全顆粒数に対する割合が増加を確認した。さらに蛍光顕微鏡を用いてpH指示薬により標識したMIN6細胞を検証し他結果は、糖毒性、脂肪毒性による刺激は実際に分泌顆粒内酸性度を低下させた。、
これらの結果より糖毒性、脂肪毒性はV-ATPase機能を障害し分泌顆粒内酸性化を阻害することで、プロセシングエンザイムの酵素機能を低下させ、プロインスリンプロセシングを障害することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2021年度は単離膵島と膵β細胞腫瘍株を用いて糖毒性・脂肪毒性によるプロセシングエンザイムの酵素機能低下とプロインスリンプロセシングが実際に障害されることを分子生物学的、および形態学的に明らかにした。さらに分泌顆粒内酸性化に重要な役割を果たすV-ATPaseの機能に着目し、糖毒性・脂肪毒性によりV-ATPase機能障害が誘導されることを細胞分画法で明らかにした。そして蛍光pH指示薬を用いて実際に分泌顆粒内酸性度を検証し、各刺激により酸性度が低下する結果を得た。一方で当初予定していたGLP1製剤のプロインスリンプロセシングに与える影響については、in vitroの検討において改善させるような効果は得られなかった。これは膵β細胞に対する直接的な効果ではなくin vivoにおける膵外作用を介した結果であることが考えられた。

Strategy for Future Research Activity

2022年度は単離膵島を用いた形態学的検討をさらに進め、分泌顆粒内におけるプロインスリンプロセシング障害を多角的に評価する。また小胞体ストレスモデルであるAkitaマウスと肥満糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウスを用いて同様の検討を進める。そして様々な糖尿病モデルマウスからの単離膵島を用いてin vitroでのプロインスリンプロセシング障害を検証すると共に、in vivoでの検証を進め、血液中のプロインスリン/インスリン比とグルコース応答性インスリン分泌におけるプロインスリン分泌の割合を検証する。また分泌顆粒内酸性化については、V-ATPase機能を中心に、膵β細胞系腫瘍株を用いて糖毒性・脂肪毒性による機能障害の詳細な機序を詰める。