2021 Fiscal Year Research-status Report
Cell Therapy Development for Congenital Metabolic Diseases Using Human Amniotic Epithelial Cells
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20K17522
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
高野 智圭 日本大学, 医学部, 助教 (50845310)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ヒト羊膜上皮細胞 / 多能性幹細胞 / 上皮間葉転換 / 先天性代謝異常症 / TGF-β / SB-431542 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和3年度も対象となる妊婦から書面の同意を得て、胎盤からヒト羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells: hAEC）の分離・保存を行い、検討に用いた。
前年度に行ったRNA-seqの差次的発現遺伝子解析によって見出されたいくつかの遺伝子について、RT-qPCR法で発現比較解析を行った。特にTGF-βのType Iレセプター（ALK5）選択的阻害剤であるSB-431542を添加して、上皮間葉転換（epithelial-mesenchymal transition: EMT）を阻害した細胞（SB-treated）において優位に発現する遺伝子に着目して解析したところ、これら遺伝子の多くはEMTが起きた細胞（Control）より発現が高く、培養開始前の細胞（day0）とは同程度の発現が保たれていることがわかった。
TGF-β経路におけるSB-431542の効果はWestern blot法を用いて検証し、Smad2/3のリン酸化が有意に抑制されていることを確認した。
さらにヒトES/iPS細胞表面に存在する糖鎖に高い親和性を持つrBC2LCNというレクチンを用いて、SB-treatedとControlの細胞特性を評価した。FITCで標識されたrBC2LCNを用いて解析すると、EMTを阻害した細胞（SB-treated）の方がControlよりFITC陽性細胞の比率が高いことが観察された。以上は前年度に示した「TGF依存性EMTの阻害によってhAECは未分化なキャラクターを保持する」ことを支持する結果であった。
最後に、軟寒天コロニーアッセイを用いてin vitroにおけるhAECの造腫瘍性試験を行った。hAECはSB-treatedおよびControlどちらにおいてもコロニー形成能を認めず、hAECが細胞移植のソースとして用いる際に、安全性の高い細胞であるということが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和3年度は19例の胎盤からhAECを分離した。前年度と同様にプロトコルの微細な調整を重ね、安定した細胞分離、保存を行うことが出来た。さらに、臨床応用に向けた取り組みとして、Good Manufacturing Practice（GMP）に準拠した臨床試薬を用いて細胞分離を行うことが出来た。
また上記概要にある結果をまとめ、二つの関連学会（The Transplantation Society、日本胎盤学会）で発表し、英文誌に投稿した（査読中）。
以上より研究は概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNA-seqの差次的発現遺伝子解析によって見出された遺伝子についてさらなる検証を重ねる。特にhAECの多能性と分化に関わるTGF-β経路やWnt経路のcross talkについて洞察を深めたいと考えている。
PhoenixBio社との共同研究については、cDNA-uPA/SCIDマウスに対するhAEC移植実験を予定している。初回の検討においてはhAECをマウス肝に移植し、マウスの体重増加は良好であったが、マウス肝への細胞生着は確認することが出来なかった。次年度の移植実験に向けてさらなる検討が必要であり、特に移植前in vitroでの肝前駆細胞への分化誘導について検討したいと考えている。また、異種の組織内におけるhAECの効率的な同定方法についても、並行して検証していく予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度に続くCOVID-19流行により、産婦人科病棟への立ち入りを控え、胎盤採取が十分に出来ない時期があった。プラスチック製品の流通不足があり購入を延期した物品があったので、流通が再開し次第購入したいと考えている。また学会の現地参加は引き続き困難であり、オンラインで参加となったため、旅費等に計上していた経費は未使用となった。次年度はCOVID-19の流行状況を鑑みながら、共同研究先への訪問に使用したいと考えている。
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