肝芽腫の新規標的ADAM32の制御とPrecision Ｍedicineへの応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17554
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 深澤 賢宏 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 研究員 (80734285)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ADAM32 / RNA修飾 / m6A / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

ADAMファミリーは、様々なヒトがん腫において発現変動が報告されており、ADAMの機能を阻害することで、制がん効果が期待できるという報告がある。これまでに、我々は患者検体の解析から、肝芽腫において特異的に発現亢進する分子としてADAM32を見出し、肝芽腫細胞株を用いて細胞機能を解析した所、がん遺伝子としての役割を持っていることが明かになりました。このことから、ADAM32の発現や作用を制御することにより、肝芽腫の進展を制御できる可能性が考えられました。一方、ADAMを標的とした阻害剤は生理的な機能にも広汎にわたり影響してしまうことが考えられます。そこで、ADAM32の発現機構や機能の詳細を解明して特異的な作用点を見出し、ADAM32発現や機能を制御することを目的に本研究を開始しました。肝芽腫のような固形がんの微小環境である低酸素に着目して、発現制御機構について解析を進めました。肝芽腫細胞株HepG2を1％O2に48時間曝露させた所、mRNAの安定性が高まり、発現が高くなることが分かりました。そこで、mRNAの安定性に関わると考えられる、5’UTR、3’UTRを組み込んだルシフェラーゼレポーターを作成し検討した結果、通常酸素、低酸素下において、活性に差を認めませんでした。そこで、mRNAの発現制御の機構として、RNA修飾の中でもm6Aメチル化に着目して解析を進めることとしました。メチル化の解析に必要な、m6Aメチル化に関わる分子をノックダウンした細胞の作製や、m6Aメチル化検出法の最適化を行いました。次年度以降、これらを用いてm6Aメチル化によるADAM32発現制御機構の詳細を検討していく予定です。また、先の研究より、ADAM32が外因性アポトーシスシグナルに影響していることが示唆されたため、抗FAS抗体を用いてアポトーシスを誘導する実験条件の検討を行いました。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、新型コロナ感染症の拡大に伴い、研究実施が制限されて新たな研究課題に取り組むことができなかたったため、計画全体に遅れが生じました。研究開始は遅れましたが、発現制御の解析に必要なレポーターの作製などを行い、低酸素におけるADAM32発現亢進のメカニズムとしてm6Aメチル化の可能性を見出しました。そして、メチル化を解析するのに必要な細胞株、レポーター作製、m6A検出法の検討を行いました。次年度以降、これらを用いてm6Aメチル化による発現制御の詳細を検討していきます。また、アポトーシス誘導実験に取りかかり、実験条件の検討を行いました。次年度は、ADAM32の発現を変動させて、ADAM32の外因性アポトーシスシグナルへの影響の詳細を検討していく予定です。

Strategy for Future Research Activity

mRNAの発現を制御する機構としてm6Aメチル化を検出する方法の最適化、m6Aメチル化に関連する分子をノックダウンした細胞の作製を行いましたので、これらを用いて、m6Aメチル化によるADAM32発現制御の詳細を、細胞生物学的解析、生化学的解析、網羅的遺伝子発現解析により検討していきます。また、ADAM32の発現を変動させて、抗FAS抗体を用いてアポトーシスを誘導することにより、ADAM32の外因性アポトーシスシグナルへの影響の詳細を細胞生物学的解析、生化学的解析により検討することで、ADAM32と相互作用する分子の探索を行っていきます。

Causes of Carryover

コロナ感染症の拡大により新規の研究課題への取り組みが制限され、研究開始が遅れたため次年度使用額が生じました。
令和３年度の予算と合わせて細胞生物学的実験、生化学的実験の試薬、消耗品購入、研究発表に使用する予定です。