胚盤胞補完法を用いた移植可能な肝臓作製技術の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17561
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 鈴木 悠地 岩手医科大学, 医学部, 特任講師 (00779332)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 肝移植 / 胚盤胞補完法 / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、[課題１]胚盤胞補完法により肝臓欠損個体において多能性幹細胞由来の肝臓を作製し、作製肝臓の組織学的・機能的評価を行うこと、[課題2]胚盤胞補完法により作製した肝臓を同所肝移植することで、作製肝臓が移植可能な臓器として機能することを証明することを目的とした。[課題１]については、肝臓欠損マウスの胚盤胞期にEGFPでラベル化したEGFP-ES細胞を移入して、ES細胞由来の肝臓の作製を試みた。ES細胞の移入により、肝臓欠損マウスで肝臓が形成され、成体まで問題なく成長することを確認した。肝臓の各種構成細胞を対象とした組織学的解析では、胆管細胞はほぼすべての細胞がEGFP陽性であるのに対して、肝細胞ではEGFP陽性細胞が10%程度と低値であった。そこで、肝細胞でEGFPのサイレンシングが生じている可能性を考え、肝細胞特異的にtdTomatoを発現するEGFP-ES細胞を樹立した。現在、肝細胞特異的にtdTomatoを発現するEGFP-ES細胞を用いて、肝臓補完動物の作成を進めている。[課題2]については、移植外科医の協力のもと、研究のゴールであるマウス同所肝移植手術の安定化を進めた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Microinjection法による肝臓補完の作成効率が当初予定していたよりも低いという問題を抱えている。現在、aggregation法を用いて肝臓補完動物の作出を進めている。肝臓補完動物の取得のための至適条件の検討に時間を要している点で（３）やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

aggregation法を含めた肝臓補完動物取得のための至適条件の探索を継続する。作出した個体について多能性幹細胞が肝細胞、胆管上皮細胞、類洞内皮細胞などの肝臓の各種構成細胞のうち、いずれの構成細胞に効率的に分化しているか肝臓の各種構成細胞に対する免疫染色で評価する。また、肝臓の各種構成細胞のドナー細胞とホスト細胞とのキメリズムを定量化する。コラゲナーゼ灌流法により処理して得られた細胞画分から、 MACSまたはセルソーターで肝細胞、類洞内皮細胞等の各種構成細胞を単離する。単離した各種構成細胞について、フローサイトメトリーや digital PCRでキメリズム解析を行う。

Causes of Carryover

実験消耗品費の誤差の範囲で未使用額が生じた。次年度の予定計画の中で繰越金額を使用する。