循環腫瘍細胞を用いた肝細胞癌の転移制御のための研究

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17654
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 濱岡 道則 広島大学, 医系科学研究科(医), 専門研究員 (70805639)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 循環腫瘍細胞 / 肝細胞癌 / 癌免疫

Outline of Annual Research Achievements

免疫不全マウスにHepa1-6にGlypican3(GPC3)を発現させた細胞を尾静脈に注入し、循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell; CTC)の検出を試みた。しかしGPC3の発現率が低く、十分な検出が不能であった。EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)やGFPの導入でも試みたが検出力は低く、腫瘍の増殖過程とCTCの関連については評価できなかった。
炎症性サイトカインと癌増殖およびCTCの関連についての解析では、マウスの肝切除モデル、肝壊死モデルを使用した。肝壊死モデルの方が肝腫瘍数および腫瘍占拠率が有意に多かった。両者のモデルで、day0でのサイトカインの変化を1、3、6時間でq-PCRを用いて検討した。IL-6、TGF-βは両群で差は認めなかった。
次に、腫瘍増殖の差が免疫的な変化によるものと仮説を立てて実験を行った。生着した腫瘍の腫瘍内CD8+、CD4+T細胞を蛍光免疫染色で評価した。肝壊死群の腫瘍の方がCD4+T細胞が多い傾向を認めた。
一方、肝細胞癌患者におけるCTC検出の検討を行った。以前より症例数を増やし、347例の検討では、GPC3陽性CTCが5以上の患者は有意に予後不良であることを確認した。また、末梢血中よりも門脈血中にGPC3陽性CTCが多く検出されることが判明した。門脈中のCTCは門脈浸潤を伴う症例で有意に多かった。さらに、門脈血CTCが多い症例は予後不良であり、独立した予後不良因子であった。
門脈血中にCTCが多い影響としてサイトカインが末梢血と門脈血で差があるのではと仮説を立てた。HCCの増殖に寄与すると考えられるCXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL5の測定を行った。CCL2、CCL5、CXCL8は末梢血より門脈血で高値であった。門脈血CTCに着目し、CTCの多い群と少ない群の比較では門脈中のCXCL9、10で有意差を認めた。これらが癌の脈管侵襲、血管内への播種に寄与している可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスを用いたCTCの検出に難渋している。
一方で、肝虚血と癌増殖とサイトカインの関連について実験の方向性が定まった。
さらに、肝細胞癌患者のCTCの分布とサイトカインに着目した。CTCは末梢血よりも門脈中に多く存在し、門脈行性に転移しやすい特徴をとらえたものと考えられた。またその影響としてサイトカインが影響している可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

マウスを用いたCTC検出ではpositive selectionからnegative selectionで行う予定である。
サイトカインと癌増殖について、マウスモデルでは虚血モデルと肝切除モデルのサイトカインの経時的変化の差を評価する。また、マイクロアレイにより発現遺伝子の同定を行う予定である。
肝細胞癌患者のCTCとサイトカインの関連についてはデータの追加をしていく。さらに、末梢血、門脈血中の免疫細胞についても解析していく。

Causes of Carryover

（理由）学術集会での発表を行う予定であったが、データ不十分のため発表は行えず、旅費は使用しなかった。
（計画）マウスのCTC検出をpositive selectionからnegative selectionに変更する予定であり、それに必要な物品の費用に充てる。