2020 Fiscal Year Research-status Report

The mechanism of hydrogen-effect in ischemia-reperfusion injury model of lower extremities using live imaging

Research Project

Project/Area Number	20K17728
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	鳥崎友紀子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (30867487)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	虚血再灌流 / 水素 / 末梢血管 / マウスモデル
Outline of Annual Research Achievements	虚血再灌流障害とは、虚血が生じた部位に血流が再開し急激な酸素負荷が生じることで、虚血部位のみならず遠隔臓器にも障害を生ずる病態のことであり組織が長時間の虚血に陥った場合細胞死を起こす。細胞死を起こす前に虚血が解除され血流が再開すると、急激な酸素負荷によってミトコンドリア内での好気性代謝が急激に回復することで、活性酸素種(ROS: reactive oxygen species)産生が増加し、細胞障害が起こるとされている。このような虚血再灌流障害に伴って発生するROSに対して、水素が選択的な抗酸化作用を有していることが示されており、現在、種々の酸化ストレス反応に対する水素の抑制的な効果を示した研究が報告されている。一方、水素の酸化ストレス抑制作用について、無細胞系と細胞培養系を用いた実験での提唱はあるものの、生体内でのメカニズムの解明には至っていない。本研究では下肢虚血再灌流モデルマウスに水素ガスを吸入投与することによってROSが減少することを、リアルタイムイメージングシステムを用いて観察することと、ROSの減少によって虚血再灌流に伴う組織の酸化障害が抑制されることの証明を目的としている。本年度は、過去の我々のグループが開発した方法を元に人工呼吸器管理下の下肢虚血再灌流マウスモデルを作製した。当初予定していた蛍光顕微鏡による観察がCOVID－19の影響で他施設での実験が困難であった為、本学所有の組織レベルでのin vivoイメージングが可能なマルチアプリケーションイメージングシステムで観察する実験系を確立し、虚血再灌流後に経時的に皮下組織内のROS発生が上昇する所見を得た。また、病理組織学的評価では、下肢虚血再灌流モデルマウスの筋組織に対する8-OHdG染色によって複数の細胞核が染色される所見を認めており、虚血再灌流によってROSの発生及びDNA酸化障害が生じていることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 下肢虚血再灌流障害に伴って発生するROSのリアルタイムイメージングの実現に際しては、当初、研究協力者（他施設）の独自に確立した生体蛍光顕微鏡システムを用いることを予定していたが、2020年2月以降、COVID-19の感染流行が拡大したことによって、他施設での実験および研究協力者との共同研究が困難となり、自施設でのシステムを開発したためやや遅れが生じた。また、緊急事態宣言の発出に伴い、自施設での実験も制限があり、実験ができない期間があった為、プロジェクト全体としてやや遅れている。
Strategy for Future Research Activity	現在行っている、人工呼吸器管理下の下肢虚血再灌流モデルマウスに対してAPFを皮下注射し、組織レベルでのROSの動態をリアルタイムイメージングとして撮像する実験を継続し、下肢虚血再灌流モデルにおけるROSの発生の視覚化について再現性をもって示すことを目指す。また、水素の効果についても検討する。ROSの発生に関する病理組織学的および生化学的な評価についてもサンプル数を増やして検討を重ね、ROSの発生やその分布について、リアルタイムイメージングによって得られた所見と局在性の一致が得られることを検討する予定である。
Causes of Carryover	当該年度についてはCOVID-19の感染流行に伴い、下肢虚血再灌流モデルマウスにおいて、APFを用いてROSの動態をリアルタイムイメージングとして撮像したサンプル数が十分でなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額はマウス購入など、主にマウスを用いた実験に充てる。また、同様の理由から当初の研究計画に遅延が生じていることを考慮して、下肢虚血再灌流モデルを用いた撮像実験ならびにROSの発生に関する病理組織学的および生化学的評価について、研究補助員を雇用を予定しており、人件費に充てる。