2021 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子改変ゼブラフィッシュによるPGE受容体EP4に着目した大動脈瘤治療薬の探索
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20K17730
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
谷藤 章太 東京医科大学, 医学部, 助教 (50529245)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / プロスタグランディン受容体 / EP4 / アンジオテンシンII / 弾性線維 / 腹部大動脈瘤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腹部大動脈瘤 (AAA)で多く産生されているPGE2受容体EP4について、疾患進行に関与するEP4発現亢進の分子機序を解明し、AAAに対する新規治療法としてEP4発現を抑制する化合物を探索することが目的である。ゼブラフィッシュをモデルとして使用し、(1) EP4-EGFPレポーターゼブラフィッシュ作製、(2) アンジオテンシンII (Ang II)負荷によるAAAモデル作製を試みた。
(1)では、R2年度にゼブラフィッシュEP4bのプロモーター候補領域をTol2ベクターに導入したコンストラクトを用いて作製したEP4レポーターゼブラフィッシュの系統樹立を目標とし、2種類の長さの異なる領域 (1246 bp、315 bp)を導入したゼブラフィッシュを飼育・維持している。In vivoでEGFP発現の確認ができている。AAA発症の起点となるEP4過剰発現の誘導メカニズムについては現在まで未解明であり、作製したレポーターゼブラフィッシュを用いることでEP4発現を制御する分子機序の解明が期待できる。
(2)では、血管をEGFPで可視化したゼブラフィッシュの1細胞期受精卵にAng IIを注入すると受精後5日目に大動脈径が増大していたが、血管弾性線維の変化を組織染色で確認するには困難であるため、8週間飼育後の血管の組織学的変化を検討した。その結果、Ang II投与群では大動脈弾性線維が断裂し、平滑筋細胞が集積していた。また、弾性線維を分解するMMP-2の発現が増加していた。これらの結果より、Ang II投与ゼブラフィッシュは血管弾性線維異常をモニターできるモデルとなる可能性が示唆された。これまでに血管弾性線維異常を評価できるモデルゼブラフィッシュは存在せず、受精後5日という早い段階で血管弾性線維の異常を抑制 / 促進する可能性のある化合物をスクリーニングできる可能性を見出すことが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)では、R2年度に作製したEP4-EGFPレポーターゼブラフィッシュの各個体のEGFP蛍光のパターンを確認しながら世代交代を継続し、個体数を維持している。現在は定量的PCRによりEP4とEGFPの発現パターンの比較を試みている段階であり、(2)のAng II投与モデルの解析を優先させていたことにより、やや進展が遅れている。
(2)の成果より、受精後5日目のAngII投与ゼブラフィッシュでの大動脈径の増大が、8週間後に確認できた血管弾性線維の異常をモニターする指標となり得ることが示唆された。順調に進展しており、現在論文投稿の準備中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、(1)ではEP4-EGFPレポーターゼブラフィッシュの各臓器でのEP4とEGFPのmRNA発現に相関があるかを定量的PCRにより検討する。また、受精後の発達に応じたmRNA発現についても同様に検討する。作製したEP4-EGFPレポーターゼブラフィッシュを用いて化合物ライブラリー (LOPAC1280、Sigma)のin vivoスクリーニングを行い、EP4発現へ影響を及ぼす化合物を見出す。化合物ライブラリーには各種受容体の作動薬・拮抗薬や、キナーゼ・プロテアーゼ等の酵素活性を制御する物質などの様々な作用機序を持つ化合物が含まれているため、EP4発現を制御する分子機序の候補を様々な細胞内シグナル伝達経路の点から検討する。EP4発現を制御する分子機序を同定できれば、EP4発現を抑制する化合物の探索が可能となる。
(2)では、本年度内に論文が受理されることを目標とする。また、(1)で見出したEP4発現へ影響を及ぼす化合物の血管弾性線維異常に及ぼす効果をin vivoで検証することが可能となり、血管弾性線維の異常を示すAAAのような疾患の新規治療薬の開発に貢献できると考えられる。
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| Causes of Carryover |
AngII投与後のゼブラフィッシュを長期間飼育して実験を行ったために当初の予定よりも時間がかかり、EP4-EGFPレポーターゼブラフィッシュの遺伝子発現を確認する実験に使用する消耗品や化合物ライブラリー等のスクリーニング関連の消耗品が未購入である。令和4年度は、未購入の消耗品を購入する予定である。さらに、論文投稿費・英文校正費として使用し、研究成果を論文発表する予定である。
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Research Products
(1 results)
