肺の再生に向けた，iPS細胞から誘導した気管支肺胞幹細胞による細胞移植の可能性

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17751
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 河北 直也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (60522266)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 幹細胞 / 再生 / 肺 / iPS細胞 / オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

令和3年度はブレオマイシン(BLM)モデルの安定化と、iPS由来の気管支肺胞幹細胞(BASCs)の培養および解析を進めた。BLMモデルに関しては、死亡率の高さを危惧し、これまでの気管切開・穿刺法から誤嚥法に移行し、さらに液量および投与の回数を調整することで、死亡率を抑えて、びまん性かつ、比較的均一な傷害モデルの作成ができるようになってきた。モデルに関して、Masson trichrome染色でAshcroftスコアおよびhydroxyproline assayによる定量的評価を進めている。
またiPS細胞からのBASCsの誘導に関してはSchmeckebierらの方法を用いた24日間培養法を継続している。分化効率5%のSca-1+，CD31-，CD45-のBASCs細胞集団をセルソートし、これらをセルソースとして、単独細胞集団および、種々のフィーダを用いた共培養法にてBASCsの３Dオルガノイド培養を進め、純度の高いBASCの単離と移植のセルソースとしての抽出を試みている。オルガノイド培養はAir Liquid Interface (ALI) 培養を主体に、いくつかの培養方法で成功を確認しており、今後はその構成細胞および多分化能を確認する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

iPSのクオリティー低下があり、また新型コロナの影響で、従来の試薬の調達が難しくなったことから、iPSの継代を再度安定化させるのに時間を要した。またプロトコールにおいてiPS細胞の分化までの時間がかかるため、進捗に影響を及ぼしている。iPS細胞が安定化して移行は、分化の安定化もすすみ、目的のBASCの誘導効率も5%前後で回収も問題なく行えている。加えてiPS誘導BASCを用いたオルガノイド形成も進んでいるが、至適播種濃度設定が決まれば高効率なオルガノイド作成が勧められると思われる。

Strategy for Future Research Activity

今後は作成されたBASCsオルガノイドにおいて、免疫染色および、フローサイトメトリーにて、その構成細胞を検討する。また、iPS由来のBASCsが多能性を有することを示すために、継代による構成細胞比率の変化や、作成されたモデル動物へオルガノイドからソートされた細胞を移植することで、in vitroおよびin vivoでのBASCsの多能性機能を有することを示す方針である。

Causes of Carryover

今年度、実験計画の予定であった分化からオルガノイド作成に様々な方法を試しており、新型コロナの影響で物品の調達に時間を要し、実験の進捗がスムーズでなかったため、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費と合わせて、BASCｓの分化誘導試薬および、BASCｓのオルガノイド作成に関わる試薬、オルガノイドの細胞評価に関わる試薬や外注に使用する予定である。