クラスリン被覆小孔形成を標的としたオピオイドの副作用発現シグナル抑制への挑戦

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17780
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 宮井 善三 京都大学, 医学研究科, 助教 (10785463)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: オピオイド受容体 / 副作用 / クラスリン被覆小孔

Outline of Annual Research Achievements

オピオイドによる呼吸抑制などの副作用は、μオピオイド受容体(MOP)がβアレスチンを活性化することが起点となると想定されている。βアレスチンの活性化の程度は、活性化したMOPが受けるリン酸化の強度に依存すると考えられており、βアレスチン経路を活性化しにくいMOPリガンドを探索すれば、副作用が少ない理想的なオピオイドが見出せると期待されている。しかし、申請者は、予備実験において、βアレスチンが起点となるMAPK経路の活性化には、MOPへのリン酸化修飾は必要ではなく、さらにはβアレスチンとMOPとが安定的に結合しなくても、MAPK経路が活性化することを見出した。そこで、活性化したβアレスチンが、MOPと離開した状態で活性型構造を維持し、シグナル伝達の起点となる分子機構を解析した。
本年度は、βアレスチンがMOPの活性化依存的にクラスリン被覆小孔(CCP)を形成することに着目した。つまり、βアレスチンは、この過程で種々の分子群と会合することで、MOPと結合しない状態でも活性化構造を維持できるのではないかという仮説を検証した。活性化したMOPは、βアレスチンやクラスリン（重鎖・軽鎖）、AP-2などの巨大な分子群と結合してCCPを形成する。そこで、CCP形成のどの過程がMAPK経路活性化において重要であるかを、エンドサイトーシスの各ステップを阻害する薬剤を利用して検証した。CCPを細胞膜から切り離すDynaminを阻害すると、MOP内在化は阻害するが、MAPKは活性化した。一方、βアレスチン、クラスリン重鎖、AP-2の3分子の会合を阻害すると、MAPK経路の活性化は消失した。さらに、βアレスチンとクラスリン重鎖との会合を選択的に抑制すると、MAPK経路の活性化はほぼ消失した。そこで、βアレスチン経路の活性化には、βアレスチンがクラスリン重鎖と会合することが重要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画では、令和2年度には、CCP形成を含むエンドサイトーシス阻害剤ライブラリーを利用して、βアレスチン経路の活性化において、βアレスチンがどの分子と会合するのが重要であるかを明らかにすることを目標としていた。現時点で、クラスリン重鎖分子とβアレスチンとの会合が重要であることを見出すことができた。さらに、令和３年度に予定していた、CCP形成に関連する分子を遺伝子学的に欠損した細胞株を利用した解析に着手している。そのため、研究計画は概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度は、CCP形成に関与する分子を遺伝学的に欠損した細胞株を樹立し、さらに詳細な解析を進める。令和３年度以降は、これらの解析によって得られた結果が、in vivoでも同様であるかをマウスを用いた動物実験で明らかにする。具体的には、上記の解析によって見出したクラスリン阻害剤を利用し、モルヒネなどのオピオイドによって誘発される呼吸抑制（呼吸回数の減少）効果が軽減されるかを解析する。また、オピオイドの鎮痛効果に対しても、抑制的な作用を示すことがないかについても慎重に解析する。