2021 Fiscal Year Research-status Report
敗血症関連脳症の機序解明およびグルタチオンによる抗酸化作用関与の解析
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20K17822
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
小林 賢礼 東京医科大学, 医学部, 助教 (80837724)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 敗血症 / GSH / 英文投稿 / 論文掲載 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では酸化ストレス耐性を持つであろうCypD KOマウスを用いてSAEモデルを作製することで、GSH/CypD/SIRT3情報伝達系という新たな切り口からGSHの抗酸化作用を分析するとともに、GSH生成のためのxCTの機能解析を進めることで、CypD ・MPTを介したミトコンドリア機能不全とSIRT3を介したミトコンドリア保護機構の役割解明に展開し、クライオ電子顕微鏡によるMPTporeの構造解析を行うことで未知のMPTporeの役割解明に繋げることから新規脳保護法確立を独創的かつ創造的に目指している。
SAE発症によるROS産生とGSHの抗酸化作用の機序解明およびxCTの機能解析と併せてGSH/CypD/SIRT3情報伝達系の果たす役割の解明に対して、第10～16週令の雄性C57B6 wildマウスをwild群、CypD KOマウス群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製0, 6, 18時間（各時間・両群とも5匹のマウスを使用）後の脳サンプルを用いてWestern BlottingなどによるxCT蛋白の発現解析やメタボローム解析を行った。また、xCTの機能解析としては、システイン供給経路としてN-Acetyl-L-cysteine (NAC)投与群を作製しxCT蛋白の発現解析、CLP処置後の生存率と病理学的解析を行い、GSH/xCT/CypD情報伝達系の役割解明を目指した。
メタボローム解析を主軸として、GSHの抗酸化作用およびCypD KOマウスとの関係性からミトコンドリア機能不全との関連が推察され、英文投稿および論文掲載を達成できた。
ただし、NAC投与群に関しては、敗血症モデル作製の不正確性か、あるいはNACの腹腔内投与の不正確性の影響か、予想され得る成果とは離れた結果となってしまい、因果関係を考察中であり次年度の改善すべき課題とされる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、SAE発症によるROS産生とGSHの抗酸化作用の機序解明およびxCTの機能解析と併せてGSH/CypD/SIRT3情報伝達系の果たす役割の解明に対して、第10～16週令の雄性C57B6 wildマウスをwild群、CypD KOマウス群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製0, 6, 18時間（各時間・両群とも5匹のマウスを使用）後の脳サンプルを用いてWestern BlottingなどによるxCT蛋白の発現解析やメタボローム解析を行った。また、xCTの機能解析としては、システイン供給経路としてN-Acetyl-L-cysteine (NAC)投与群を作製しxCT蛋白の発現解析、CLP処置後の生存率と病理学的解析を行い、GSH/xCT/CypD情報伝達系の役割解明を目指した。
メタボローム解析を主軸として、GSHの抗酸化作用およびCypD KOマウスとの関係性からミトコンドリア機能不全との関連が推察され、英文投稿および論文掲載を達成できた。
ただし、NAC投与群に関しては、敗血症モデル作製の不正確性か、あるいはNACの腹腔内投与の不正確性の影響か、予想され得る成果とは離れた結果となってしまい、因果関係を考察中であり次年度の改善すべき課題とされる。
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| Strategy for Future Research Activity |
システイン供給経路としてN-Acetyl-L-cysteine (NAC)投与群を作製しxCT蛋白の発現解析、CLP処置後の生存率と病理学的解析を行い、GSH/xCT/CypD情報伝達系の役割解明も目指したが、NAC投与群に関しては、敗血症モデル作製の不正確性か、あるいはNACの腹腔内投与の不正確性の影響か、予想され得る成果とは離れた結果となってしまい、因果関係を考察中であり次年度の改善すべき課題とする。
また、当初の次年度の目標通り、SAE発症におけるミトコンドリア機能不全誘発とCypD・MPTとSIRT3情報伝達系の連関解析およびトモグラフィー法によるタンパク質構造解析: 敗血症性脳症とMPTを介したミトコンドリア機能不全との連関解析のために、第10～16週令の雄性C57B6 wildマウスをwild群、CypD KO群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製0, 6, 18時間後（各時間・両群とも5匹のマウスを使用）に脳ミトコンドリアを抽出してCa
2+overloadをin vitroにて作り出し、ミトコンドリアの膨化（swelling）を計測、解析比
較する。マウス大脳皮質からParcol法でミトコンドリア分画を抽出し蛋白定量後、25μg/mlのミトコンドリアをKCl bufferに加えてCaCl2(0-10μmol/mgprotein)を加えて520nmでlight scatteringを行いMPTに伴うミトコンドリアの膨化率を測定しSAEを介したMPTに伴うミトコンドリア機能不全におけるCypD・MPTとSIRT3情報伝達系の連関を解析する。さらに、swellingのタイミングをモデル作製からの経過時間によってグループ分けし、各段階での検体をトモグラフィー法によるタンパク質構造解析することにより、これまで未知であったMPTのメガチャネルを視覚的に捉えることも目指す。
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| Causes of Carryover |
今年度はN-Acetyl-L-cysteine(NAC)投与群作製に難渋し、当初の想定していた実験と実際に達成できた部分との差によって、1,533,398円の差額が生じることとなった。次年度は改めて、システイン供給経路としてNAC投与群を作製しxCT蛋白の発現解析、CLP処置後の生存率と病理学的解析を行い、GSH/xCT/CypD情報伝達系の役割解明の再挑戦を次年度の改善すべき課題とする。
また、当初の次年度の目標通り、SAE発症におけるミトコンドリア機能不全誘発とCypD・MPTとSIRT3情報伝達系、敗血症性脳症とミトコンドリア機能不全との連関解析のため、第10～16週令の雄性C57B6 wildマウスとCypD KO群を用いてSAEモデル作製し、0, 6, 18時間後に脳ミトコンドリアを抽出しミトコンドリアの膨化（swelling）計測、マウス大脳皮質からミトコンドリア分画を抽出し蛋白定量後、CaCl2を加えてlight scatteringを行いMPTに伴うミトコンドリア膨化率を測定しCypD・MPTとSIRT3情報伝達系の連関解析する。さらに、swellingのタイミングを経過時間によってグループ分けし、各段階での検体をトモグラフィー法によるタンパク質構造解析することによりMPTのメガチャネルを視覚的に捉えることも目指す。上記解析のために次年度使用額が生じる。
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Research Products
(2 results)
