微量DNA捕捉ナノワイヤと迅速SNP検出装置を用いた脳腫瘍リキッドバイオプシー

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17927
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 栗本 路弘 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (40806501)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 脳腫瘍 / ゲノム解析 / SNP / リキッドバイオプシー / IDH1 / TERT

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子異常に基づく神経膠腫の病型分類に必要な遺伝子変異を術中に極めて短い時間でまとめて診断する技術を継続開発した。既に IDH1 変異に対して技術を確立したが さらに TERT、EGFR、BRAF、PTCH1などのhot spot 変異をもつ遺伝子変異に対してもプローブ開発を行い、多数の原発性脳腫瘍に対応できる術中オールインワン診断システムを構築し臨床応用を開始した。
これらの遺伝子変異の解析をすすめるため、利用可能な細胞株を検索し過剰発現細胞株を作成、強制発現プラスミドベクターを作成した。蛍光プローブであるQプローブを用いて、全自動 SNPs 解析装置 i-densyで解析した。上記解析の対象となった同一腫瘍組織の残検体を用いて、同定された異常があることをアンプリコンシークエンスにて変異を同定し比較対象とし、QIAamp DNAMini Kit (QIAGEN)を使用して腫瘍からDNAを採取、対象遺伝子および各染色体のhetero DNAに対して作成した Not Ⅰ配列付きプライマーを用いたPCRを行い対象領域のアンプリコンを作成、アンプリコンを Not Ⅰにてdigestion した後、T4 ligase にてligation を行うことにより長鎖 DNAを作成し、次世代シークエンサー用のアダプター配列をligationしHiseq 2500でシークエンスを行うことで、1%までの低アレル頻度の変異を高い正確性をもって判断することができた。染色体コピー数異常についてはさらに正確性を高めるため MLPA法を用いて再解析を行った。また髄芽腫および頭蓋内胚細胞腫瘍が疑われる患者に対し、上記で確立した技術を用いて摘出検体に対する遺伝子変異の術中迅速診断を試みた。引き続き、術前病理診断と術後確定病理診断とも比較し迅速遺伝子診断の有用性を評価する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GLI2、H3F3Aなどのhot spot変異に対して再度解析を行ったが、強制発現プラスミドベクターの作成が困難であった。胚細胞腫瘍においてはターゲットとなるSNPでの解析結果に再現性がなく、診断意義と併せて再評価する必要性があると考えている。

Strategy for Future Research Activity

対象となる疾患群に対してのSNP解析による診断意義を再考する。
新規脳腫瘍分類において、遺伝子分類が必須となるものが多数登録されたため、それらの疾患群においても迅速診断、早期治療介入の一助になるべく腫瘍種、ターゲットSNPをさらに増やして対応する予定。

Causes of Carryover

国内での研究打ち合わせや学会での発表が感染流行のため実施することが困難であった。
物品費に関しては本年必要分が過少であったため、次年度以降は必要量が増加する見込みである。