2021 Fiscal Year Research-status Report

段階的分化誘導法による骨格筋筋芽細胞分化過程におけるストレスシグナルの役割の解明

Research Project

Project/Area Number	20K18011
Research Institution	Tokyo Women's Medical University
Principal Investigator	菊地鉄太郎東京女子医科大学, 医学部, 助教 (00650805)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	骨格筋 / 筋芽細胞 / 分化 / 筋管形成 / ストレスシグナル / p38シグナル / ERストレス
Outline of Annual Research Achievements	骨格筋の再生・修復に関わる筋芽細胞の分化過程にはp38やUnfolded Protein Response（UPR）などのストレスシグナルの関与が示唆されている。これらのストレスシグナルはMyoD発現の上昇等がみられる分化前期と筋線維の形成が起こる分化後期で異なる役割を持つと考えられるが、従来の分化誘導法ではこれらの区別が難しかった。本研究では、筋芽細胞の分化段階を可能な限り厳密にコントロールすることで、各分化過程におけるストレスシグナルの役割を個別に明らかにすることを目的としている。前年度までにFGF-2とTGF-β1が濃度依存的かつ協同的に筋芽細胞のelongationおよび筋管形成を抑制することを確認したが、ポピュレーション解析の結果、筋管形成前の細胞についても増殖期と分化期の２つの段階が存在することが示唆された。そこで本年度では様々なシグナルがこの２つのポピュレーションにどう影響するかを検討した。その結果、TGF-βシグナルとERK1/2シグナルは分化抑制に、PI3K-Aktシグナルは分化促進に寄与することが分かった。一方でp38シグナルはこの段階での分化にはあまり影響が見られなかった。これらの結果は従来筋管形成を抑制または促進することが示されていたシグナルの中には、筋管形成前のフェノタイプ変化において働いているものと働いていないものがある可能性を示す。このように筋芽細胞の分化過程を段階的にとらえることで、骨格筋の再生過程をより詳細に検討することができ、廃用性委縮などの筋疾患の病態の解明に繋がることが期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初計画では当該年度はヒト骨格筋筋芽細胞を用いた段階的分化誘導法を確立し、各段階での転写因子の発現量の時間的変化と細胞形態・筋線維形成との関係について調べる計画であった。しかし、分化過程の筋芽細胞は単一ではなく、いくつかの細胞群の混合であることがわかったため、フローサイトメトリーによるポピュレーション解析を中心に研究を行うこととした。本研究の主題である段階的分化誘導については、筋管形成を抑制することが知られているシグナル阻害剤の利用も検討したが、細胞内シグナルへの非生理的な影響が懸念されたため、細胞を疎に播種することで細胞融合を防ぐ方法を採用した。この方法では回収可能な細胞数が非常に少ないため、解析中の細胞のロスを極力減らすためのプロトコルの改良が必要であった。また、血清による不確定な要素を除外するため無血清培地を採用したが、無血清培地においても分化の程度にゆらぎが見られたため、Chemically-definedの培地へ変更した。以上の検討により、筋芽細胞の筋管形成前のフェノタイプ変化を解析する方法を確立した。本法により増殖因子や阻害剤によるシグナル解析を行うことができた。当初計画とは手法において異なるアプローチとはなったものの、筋芽細胞の段階的分化誘導法と解析方法が確立できたことから、総合して研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	次年度以降はフローサイトメトリーと細胞純化手法やセルソーティング、免疫組織化学等を組み合わせて筋芽細胞の分化過程のさらなる詳細な解析を行っていく。分化過程前半については、増殖型細胞と分化型細胞の分離を行い、遺伝子発現を比較する。分化に影響するシグナルについても引き続き検討する。分化後半の段階である細胞融合・筋管形成については、前段階の分化型・増殖型と筋管形成の関係について明らかにするとともに、細胞融合を抑制または促進する分子シグナルについて解析を行う。