2021 Fiscal Year Annual Research Report
NGSと新規迅速PCRによる骨軟部組織感染症迅速診断法の研究
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20K18013
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
外山 雄康 関西医科大学, 医学部, 助教 (50829306)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨軟部組織感染症 / 迅速PCR / 次世代シーケンサー / 超音波処理法 / 骨髄炎 / 化膿性腱鞘炎 / 全自動遺伝子抽出装置 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度に実施した研究の成果について1)内容 2)意義 3)重要性
1)内容: 2020年度に行なった超音波処理法後, DNA抽出し, 迅速 PCRおよび NGSによる分析をすすめ、追加臨床検体、標準金株や臨床分離株を用いた基礎的検証を行なった。 腱・滑膜・骨など従来法と超音波処理法で培養検査を行い, 臨床的有用性の最終報告を行った. 臨床保存検体を PCRおよび NGSで検証し、既存の検査方法および臨床経過との観察研究を行った. 臨床検体や標準菌株・臨床分離株における DNA抽出法の検討および 8F- 338R primer (16S rRNA定量PCR, NGS)にて検証を行い, 検体採取箇所による差異や磁気ビーズ法 (MagLEAD12gc)による DNA抽出におけるPCRやNGS結果による, 遺伝子抽出手法における検討を行なった。また、迅速PCR検査およびnanoporeシーケンサーの基礎的検討を行なった。
2)意義: 骨・軟部組織バイオフィルム内細菌叢の解明, バイオフィルム感染症の遺伝子機器を用いた迅速検査手法・診断/治療プロトコールの構築を目的とし, 詳細なプロトコール決定における基盤技術の創出と精度向上を目指し上記内容の研究を前年度に追加し検討を行った.
3)重要性: 遺伝子抽出の問題に関し, DNA抽出の一般的な方法である QIAamp DNA mini kit (Qiagen)(QIAGEN法)を用いたものは時間と手間を要し, 全自動機器magLEADでは作業効率の改善、精度向上が検証できた。また, 骨軟部組織感染症における超音波処理法の有用性をまとめ, 保存検体の qPCR後, DNA保存を行いNGS等の検証に至った. 検証結果より同一感染症例においても検体採取間でのばらつきを認め, 定量的評価の有用性を確認した.迅速PCRにおける検討は、既存の特異的領域のPCRに加え、変異遺伝子を多く含む16sDNAの定量PCRを行えるように、プロトコールの構築を行なった。nanoporeシーケンサーにおける陽性コントロールを用いたプロトコールの検討を行なった。
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