Myostatinによる未分化間葉系細胞の腱細胞への分化誘導メカニズムの解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18028
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 北村 陽 信州大学, 医学部附属病院, 医員 (00836033)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 腱細胞 / 未分化間葉系細胞 / 分化誘導 / myostatin

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでにMyostatinの刺激により、マウス筋芽細胞株C2C12を腱組織の恒常性維持や損傷後の修復において重要な役割をなす腱細胞へ効率的に分化させる 培養系を確立し、そのシグナル伝達経路を明らかにした。本研究ではより未分化な間葉系細胞株C3H10T1/2から腱細胞への分 化を誘導する新たな培養系を用い、 1)Myostatinによる未分化間葉系細胞の腱細胞への分化誘導時に活性化されるシグナル伝達経路、2)Myostatinの拮抗蛋白であるFollistainの腱細胞分化における 機能、3)Myostatinの生体内に存在する腱幹/前駆細胞から腱細胞への分化に与える影響、の3点を解明する。
当該年度では、各腱細胞マーカー についてリアルタイムPCRによる定量を行い、腱細胞分化が最も抑制されるシグナル伝達経路を同定を行った。その後同様の培 養系を用いて、同定されたシグナル伝達経路において機能する分子をsiRNAによりノックダウンし、腱細胞マーカーについて上記と同様に定量を行い、腱細胞への分化への影響を解析した。また同培養系を用いてMyostatinの拮抗蛋白であるFollistatinの腱細胞分化に与える影響を腱細胞マーカーについてリアルタイムPCRによる定量を行い、解析を行なった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

前年度において、まずC3H10T1/2を低血清(2%FBS)で12時間培養した後にMyostatinと各シグナル伝達経路の選択的阻害剤を添加する。培養3日目にRNAの抽出を 行い、各腱細胞マーカー についてリアルタイムPCRによる定量を行い、腱細胞分化が最も抑制されるシグナル伝達経路を同定を行った。その後同様の培養系を用 いて、同定されたシグナル伝達経路において機能する分子をsiRNAによりノックダウンし、腱細胞マーカーについて上記と同様に定量を行い、腱細胞への分化へ の影響を解析した。当該年度においては同培養系を用いてFollistatinの腱分化誘導の抑制効果について、リアルタイムPCRによる検討を行なった。実験の至適条件の検討（添加するFollistatin濃度）に時間を要したため、本研究に予定より時間を要してしまったため実験の進捗が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

Myostatinの腱幹/前駆細胞から腱細胞への分化に与える影響:腱幹/前駆細胞のマウスからの採取および培養についてはBiらの方法(Bi et al . Nat Med.2007)に 準じて行い、リアルタイム PCR、ウェスタンブロットによる腱細胞マーカーの定量および免疫染色により腱細胞への分化を確認する。Myostatinの濃度や培養期 間についての至適条件の検討も行う。

Causes of Carryover

実験進行の遅延のため予定していた金額より少ない支出になった。
次年度に当該年度で予定していた実験も行う予定である。