Development of a novel immunotherapy for bladder cancer with SORL1 signaling and tumor immune microenvironment

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18126
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 内海 孝信 東邦大学, 医学部, 助教 (80594275)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 膀胱癌 / SORL1 / PD-L1 / Cdc42

Outline of Annual Research Achievements

SORL1をknock-outした細胞ではcontrol細胞と比較して、有意に遊走能・浸潤能が上昇することを確認した。遊走能・浸潤能が上昇する機序を解明するために、Rhoファミリー分子を中心とした細胞骨格の制御に関与する分子をウェスタンブロット法で検証した。SORL1をknock-outした細胞ではcontrol細胞と比較して、細胞の糸状仮足の形成を引き起こすCdc42およびリン酸化Cdc42の発現が上昇していることが確認された。Cdc42シグナルは膜型MMP（MT1-MMP）シグナルと協調してがん浸潤突起（invadopodia）を形成することが報告されており、SORL1-Cdc42シグナルは既存の阻害剤も存在するため、膀胱癌の浸潤・転移機構の抑制を目的とした新規治療標的分子になり得ると考えられた。
SORL1をknock-outした細胞においてもcontrol細胞においてもPD-L1が発現していることをウェスタンブロット法で確認した。また、control細胞とSORL1 knock-out細胞にインターフェロンγ（IFNγ）刺激を加えた後に細胞膜表面のPD-L1の発現をフローサイトメトリー法で確認した。可溶性画分を検出するウェスタンブロット法だけではなく、フローサイトメトリー法で細胞膜表面上のPD-L1発現も確認できたので、免疫応答性のあるC57BL/6マウスを評価モデルとした抗PD-1/PD-L1抗体療法も検証可能と考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SORL1の分子ネットワークを詳細に解析することを目的として、遊走能・浸潤能に関与するシグナルを解明した。実験結果から細胞の糸状仮足の形成を引き起こすCdc42およびリン酸化Cdc42の発現が上昇していることを確認できた。既存の阻害剤もあるため治療標的としての検証が期待された。また、IFNγ刺激を加えた後に細胞膜表面のPD-L1の発現をフローサイトメトリー法で確認し、SORL1 knock-out細胞においてもPD-L1が発現していることを確認できたため、膀胱癌におけるSORL1を中心とした腫瘍免疫微小環境の解明と新規免疫療法の開発にも繋がると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

膀胱癌におけるSORL1の機能解析から、SORL1は遊走能・浸潤能を制御している腫瘍抑制遺伝子であると考えられる。今後はSORL1-Cdc42シグナルの解析と細胞骨格再構成の観察を予定し、Cdc42の下流にあるN-WASPやApr2/3 complex、invadopodia形成に関与するMT1-MMPの発現量をウェスタンブロット法で確認する。
SORL1 knock-out細胞とcontrol細胞を用いて、Cdc42-N-WASP-Apr2/3 complexシグナルを標的としたCdc42阻害剤（MLS-573151）およびN-WASP阻害剤（Wiskostatin）、Apr2/3 complex阻害剤（CK-666）を用いて遊走能と浸潤能が最も効果的に抑制される標的分子と阻害剤の組み合わせをin vitroで探索する。基本的な機能解析で治療効果を確認した後に、治療薬による下流シグナルの抑制（ウェスタンブロット法）やinvadopodia形成の抑制（蛍光細胞免疫染色）、MMP分泌の低下（ゼラチンザイモグラフィー）を確認する。これらの阻害剤はSORL1 knock-out細胞で治療効果がより大きいと想定しているが、ELISA法で細胞培養液中の可溶型SORL1の測定を行いSORL1のネガティブ・バイオマーカーとしての可能性も検証する。

Causes of Carryover

in vitroの解析に使用する実験器具や抗体はすでに所有しているものと共通なものもあったため効率的に実験遂行ができた。次年度以降はin vitroで候補となる治療薬の購入やin vivoの実験準備もあるため、使用する金額は令和2年度より高額となると想定している。