アデノ随伴ウイルス-CRISPR/Cas9を用いた卵巣癌の新規遺伝子治療戦略

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18171
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 八幡 環 和歌山県立医科大学, 医学部, 客員研究員 (90647562)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: AAV-CRISPR/Cas9 system / 卵巣癌 / PD-L1

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではAAV-CRISPR/Cas9 systemを用いて、卵巣癌に発現するPD-L1遺伝子を欠損させることで、新規遺伝子免疫療法の有用性を実証することを目的としている。
① AAV-PD-L1粒子の作製：PD-L1遺伝子のゲノム領域断片とGuide-it-down-control annealed oligosをpAAV-guide-it-down vectorにそれぞれ組み込み、Stellar Competent Cellsをtransformationした。培養の上、菌体回収後、DNA精製を行った (名称：Guide-it-down-Pdl1 vector、Guide-it-down-Control vector、Guide-it-up vector)。次にGuide-it-down-pdl1 vectorとGuide-it-down-control vector、およびGuide-it-up-control vectorをpRC2-mi342 Vector、pHelper Vectorと共にAAVpro HEK 293T cell lineにトランスフェクトし、AAV粒子を作製した (名称：AAV-down (control)-Pdl1、AAV-up粒子)。
② マウス卵巣癌細胞株におけるAAV粒子のin vitro実験：AAV-down-Pdl1およびAAV-up粒子をマウス癌細胞株に各々transduceし，PD-L1の蛋白発現を確認した。Controlと比較して、AAV-down-Pdl1およびAAV-up粒子をtransduceした細胞株において、PD-L1発現が低下していることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PD-L1遺伝子を改変させるためのAAV粒子を作製した点、in vitroにて卵巣癌細胞株のPD-L1遺伝子が欠失した点より、概ね順調に進展していると考えるため。

Strategy for Future Research Activity

PD-L1遺伝子を欠失させるAAV-CRISPR/Cas9システムを構築したため、今後はin vivoでの実験を進める予定である。卵巣癌担癌マウスにAAV-PD-L1粒子を腹腔内投与後、腫瘍増殖抑制効果や生存率を確認し、腫瘍抑制効果を評価する予定である。

Causes of Carryover

前年度ではIn vivo実験の予定を含んでいたが、当初の予定より進行しなかったため、差額が生じたと考える。今年度は去年度に予定していたin vivo実験を行う予定のため、繰越での使用を希望します。