2020 Fiscal Year Research-status Report

がん患者のための妊孕性温存における卵細胞傷害の原因と改善方法の究明

Research Project

Project/Area Number	20K18205
Research Institution	St. Marianna University School of Medicine
Principal Investigator	鈴木由妃聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (00836992)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2022-03-31
Keywords	卵子凍結 / 妊孕性温存 / がん・生殖医療
Outline of Annual Research Achievements	初経前の小児や思春期前を含めた若年がん患者では、月経周期がなくとも施行可能である卵巣組織凍結が唯一の妊孕性温存療法となるが、移植の際にがん細胞を体内に戻してしまうリスクが伴う。本研究は安全な未熟卵子の体外培養(IVM: In Vitro Maturation)技術および未受精卵子の凍結技術の向上を目指し、培養及び凍結・融解の過程で未熟卵子や成熟卵子に起こりうる細胞傷害をミトコンドリアの動態として捉え、その細胞障害をRNA解析やトランスクリプトーム解析を通して明らかにすることを目的としている。一般に行われている未受精卵子凍結は、第一減数分裂前期(MII期)の卵子である。GV期未熟卵子を凍結するためにはIVM技術を用い、MII期の卵子とし凍結保存するが、そのIVM技術はいまだ確立されていない。というのもIVM培養後MII期卵子の凍結・融解後妊娠率は非常に低い。その原因としてIVM培養ストレスが原因と考えられる。また凍結・融解技術においては未受精卵子凍結後の妊娠率は未だ胚凍結融解後の妊娠率に追いつくことができていない。未受精卵子凍結融解技術の向上が未だ必要であることを示している。 IVM培養技術および未受精卵子凍結ともに、細胞の活性に原因があると想定し、本研究ではミトコンドリア動態に関連した傷害を立証し、技術向上を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ミトコンドリアに関連した卵子の傷害経路を確認するために、マウス成熟卵子(6-12週齢ICRマウスにPMSG 5IUを腹腔内投与し、48時間後にhCG5IU投与し、15時間後安楽死下に卵巣卵管を摘出し卵管より獲得)及び未熟卵子(6-12週齢のICRマウスにPMSG5IUを単回腹腔内投与し、24時間後に安楽死下に卵巣卵管を摘出し獲得)を使用する。IVM培養はダルベッコイーグル培地にFSH37.5 mIU/mLを添加し24-72時間の培養を行う。初めに成熟卵子群における凍結融解時の卵子傷害経路を立証する。現在実験としてシングルセルにおいて微量なRNAを回収可能な系を作り上げた。次にこの卵子おける卵子ミトコンドリアにおける動態解析として、ミトコンドリアリピート数をターゲットとし、新鮮成熟MII期卵子、未熟GV期卵子、凍結融解後MII期卵子におけるミトコンドリアリピート数の確認を実施し、解析は終了している。新鮮成熟MII期卵子、未熟GV期卵子、凍結融解後MII期卵子を用いて走査型電子顕微鏡にて細胞小器官の変化を確認した。特にミトコンドリアにおける分布および膜電位を確認するため、免疫染色としてミトグリーンおよびTREM抗体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡にて確認を実施した。現在新鮮成熟MII期卵子、未熟GV期卵子、凍結融解後MII期卵子におけるミトコンドリアにおいてFusion(融合)/Fshion(分裂)関連遺伝子を評価、つまり卵子のミトコンドリアが培養や凍結といったストレスを受けた際、ミトコンドリアの質を維持するために融合と分裂を繰り返すことが分かっており、ミトコンドリア特有のFusion/Fishion関連遺伝子(Mitofusin(Mfn)/Opa1/Drp1/Dnm1など)と連動して発現する遺伝子を確認している最中である。この結果を元に、卵子のステージや培養、凍結・融解ストレスについての評価を確認する。
Strategy for Future Research Activity	本研究は未熟卵子の体外培養技術および未受精卵子における凍結・融解技術を向上させることを目的としている。上記で示した研究を進め、細胞傷害をミトコンドリアの動態解析としてRNAシークエンスによるトランスクリプトーム解析を通じて、より細胞障害に関わる根拠を明らかにし、体外培養および未受精卵子における凍結融解技術を向上させる技術を検討する。
Causes of Carryover	当初予定していた次世代シークエンスが実施できていない。その理由としてシークエンスデータを集める前段階において、シングルセルのRNA抽出する系に時間を要したため、現在その後のデータを集積中である。そのため昨年度の予算の使用方法が変更となっている。今後、現在解析中のデータとともに、シークエンスを進めていく。