2021 Fiscal Year Research-status Report
ナノスーツ法を用いた血中循環HPV感染細胞のリアルタイムモニタリング法の確立
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20K18249
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
喜夛 淳哉 浜松医科大学, 医学部附属病院, 診療助教 (70868893)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ナノスーツ法 / 腫瘍循環細胞(CTC) / リキッドバイオプシー / 中咽頭癌 / HPV |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナノスーツ法は短時間で簡便に試料周辺にナノ薄膜を形成させ、電子顕微鏡で濡れた試料を立体構造が保たれたまま高倍率・高分解能で観察できる革新的な技術である。循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cells: CTC)は、血液腫瘍マーカーよりも病勢や治療効果を反映する可能性が示唆されており注目されている。しかし中咽頭癌を含めた頭頸部癌での報告は少ないのが現状である。
今回CTCをナノスーツ法で観察する新手法を確立し、HPVに感染したCTCを微細構造が保たれた状態で観察及びリアルタイムでモニタリングを行うことで、HPV陽性中咽頭癌の病勢や予後判定を行うことや早期癌スクリーニングへの応用も目指す。
HPVタイプ6又はタイプ11が陽性となった喉頭乳頭腫に対し、免疫染色でHPV-L1(カプシド蛋白)およびE4が陽性(ウイルス粒子の形成、放出に関与)する部位が相関することを確認した。また、RNA-ISH(in situ hybridization)においてもHPV-E4は同様に相関した。さらにその部位をナノスーツ法を用いて、走査型電子顕微鏡で観察すると約50nmの微小粒子を核内に多数認めた。さらに同部位を戻し電顕法(透過型電子顕微鏡)でも同じ部位の確認を行い、同様の微小粒子を確認した。これらはHPV粒子であると考えられた。さらにHPV粒子が観察される喉頭乳頭腫は予後不良な症例が多いことが明らかになった。
Cell free DNAにおいてCAML5、DNAJC5G、LY6D遺伝子のメチル化はHPV関連中咽頭癌の再発転移と関連することを過去に報告している。頭頸部の原発不明癌での解析においてもこれら3遺伝子がメチル化されている例があり、原発巣検索や早期スクリーニングへの応用が期待できると思われた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
今年度は昨年度に確立したHPV観察技術をさらに発展させ、ナノスーツ法(走査型電子顕微鏡)観察後に、同じ部位を透過型電子顕微鏡で観察する手法(戻し電顕法)を確立した。
また、Cell free DNAでの検討ではHPV関連中咽頭癌において有用なメチル化遺伝子マーカーが原発巣検索や早期スクリーニングに有用である可能性が示唆された。
一方で、培養細胞を用いたCTCを模倣したモデルを作成し、ナノスーツ法を用いてHPV粒子の同定を行う一連の解析手法を開発予定であったが、培養細胞自体でのHPV粒子数が少ないことが影響し効果的な解析手法が確立できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
従来のナノスーツ法で直接HPV粒子を観察する手法の追求に加え、金ナノ粒子などの標識を加え可視化しやすい状況を作成することで観察を容易にする手法を検討している(免疫電顕法)。HPVワクチンなどに利用されるHPVウイルス様粒子(VLP)を用い、HPV-L1(カプシド蛋白)に対する免疫電顕法を行い、金粒子1つあたりで捕捉できるHPV粒子数を測定することで、測定感度を確認する。その後、培養細胞や臨床検体を用い検討を行い研究課題の解決を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究計画が遅れておりCTC回収キットであるScreen Cellの購入が当初の予定より少ないためである。本年度の購入を予定しており、最終的な研究使用額は当初の予定のままである。
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