ヒトiPS細胞由来気道上皮シート移植の鼻副鼻腔への応用

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18279
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 北田 有史 京都大学, 医学研究科, 医員 (50869584)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 鼻・副鼻腔 / 移植治療 / ヒトiPS細胞 / 線毛上皮細胞 / コラーゲンビトリゲル / X-SCIDラット

Outline of Annual Research Achievements

鼻腔、副鼻腔に存在する気道上皮細胞は呼気中に含まれる微粒子を外部へ排出する役目を担っている。線毛機能不全症候群や嚢胞性線維症などの遺伝性疾患ではこの線毛運動機能が阻害されるが、根本的治療法がなく生命維持にかかわる。そこで本研究では、これらの遺伝子疾患に対する移植治療のための基盤的技術開発として、ヒトiPS細胞由来気道上皮細胞シートを免疫不全ラットの鼻腔、副鼻腔へ移植し、高効率に生着させることを目的としている。
2020年度に生体分解性膜であるコラーゲンビトリゲル膜上でヒトiPS細胞由来気道上皮細胞の分化誘導を行い繊毛上皮細胞を含む気道上皮への分化誘導が確認された。誘導したヒトiPS細胞由来気道上皮細胞を移植に関する検討として移植部となる鼻腔粘膜を掻把する面積、前鼻腔閉鎖・非閉鎖の検討、足場となるコラーゲンビトリゲルの厚みや素材、性状の検討、移植に用いるヒトiPS細胞株の選定、レシピエントラットの系統(ヌードラットもしくはX-SCIDラット)についての検討を行なった。各条件下で少数の免疫不全ラットに移植する予備的移植実験を行った結果、移植細胞が生着する条件がほぼ確立された。そこで、2021年度は移植実験の数をさらに増やし、複数のレシピエントラットの鼻腔内に移植細胞の生着を確認した。合わせてこれらのヒトiPS細胞由来生着細胞に気道上皮を構成する細胞種が含まれていることを確認した。これらの結果を論文にまとめ投稿し、受理された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020年度に見いだされた鼻腔呼吸上皮組織剥離モデルの作製と移植の条件を用い、実験数を重ねた。ヌードラットの鼻腔呼吸上皮に鋭匙で3x4 mmの掻把を作製し、理化学研究所から供与していただいたヒトiPS細胞株253G1から気道上皮細胞を誘導した。誘導の足場となるブタアテロコラーゲンビトリゲル膜は5mg/ml濃度の溶液を用いた物を選定した。また、前鼻腔閉鎖条件も検討したものの解放したままでも鼻腔内移植部位に移植細胞の生着が見られたため閉鎖せずに移植した。NBRP-Rat 分担機関、東京大学医科学研究所 実験動物研究施設、真下知二先生より御供与頂いたXSCIDラットとヌードラット各6匹で移植実験を行ったが、一週間後に組織を回収し、凍結切片の蛍光免疫染色法にて検討を行った結果X-SCIDラットでは生着が見られず、ヌードラットで生着が見られたため、今年度、更に7匹のヌードラットへの移植実験を追加し、計4匹で生着を確認できた。これらの生着細胞は管腔面上皮には見られず、嚢胞を形成した上皮と肉芽内の間葉系幹細胞のみであった。しかしながら4匹でみられた嚢胞形成上皮内には全頭で線毛上皮細胞アセチル化チューブリン陽性細胞が見られ、個体によって他の気道上皮細胞も見られた。この結果を論文にまとめ、て投稿し、数度のリバイス実験を行い、嚢胞内に繊毛上皮が存在することをHE染色でも確認しTissue Engineering PartAに受理された。

Strategy for Future Research Activity

今までの移植では生着細胞は鼻腔粘膜の管腔面には存在せず、鼻腔内で嚢胞を形成する形で生着していた。そのため移植細胞による機能改善が期待できず、治療効果はないものと考えられた。そこで、様々な条件を検討し、管腔面に移植細胞を生着させる必要がある。予備検討で用いたXSCIDラットでは生着が見られなかったため、以降より免疫抑制力の強い、
Il2rg/Rag2ダブルノックアウトラットを用いて検討を行う。またもう一つの原因として、コラーゲンビトリゲルの厚みと移植に必要な強度の検討に加え、細胞シート状での移植法の検討など、移植部周辺の上皮細胞と滑らかに連続した表層部を再生させるための検討を重ねる。以上の検討の結果、移植部上皮細胞に占める抗ヒト核抗体陽性細胞の割合が30%以上の高効率になる条件が決まれば、蛍光タンパク質を発現するヒトiPS細胞株を用いた移植を行いハイスピードカメラを用いた繊毛運動の評価や電子顕微鏡での微細構造の検
討などを行う。さらに、以上の検討結果を生かし、副鼻腔へのヒトiPS細胞由来気道上皮細胞移植の検討を行う。

Causes of Carryover

COVID-19感染症の影響で予定していた実験が一部行えず、次年度使用額が生じた。2022年4月以降に追加の実験を行い研究を進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Airway Cells on Vitrigel Membrane into Rat Nasal Cavity. (2022)
  • Author(s): Kuwata F, Ohnishi H, Yamamoto N, Takezawa T, Yamashita M, Okuyama H, Hayashi Y, Yoshimatsu M, Kitada Y, Tada T, Kobayashi M, Omori K.
  • Journal Title: Tissue Engineering PartA Volume: Online ahead of print. Pages: -
  • DOI: 10.1089/ten
  • Peer Reviewed