2020 Fiscal Year Research-status Report

Upregulation of barrier function in human sinonasal mucosa

Research Project

Project/Area Number	20K18323
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	中村真浩順天堂大学, 医学部, 助手 (20646236)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	鼻副鼻腔 / アレルギー性鼻炎 / フィラグリン / 上皮電気抵抗値
Outline of Annual Research Achievements	アトピー性皮膚炎や気管支喘息、アレルギー性鼻炎で知られるatopic diseaseの有病率が先進国を中心に現在明らかな増加の一途を辿っており、アレルゲンやアレルギー惹起物質を上皮レベルで防御することがアレルギー疾患の予防および進行の防止の上で求められている。本研究ではバリア機能関連タンパクであるフィラグリンの制御因子を探索し、バリア機能増強による新規治療を開発することを目的とした。既に我々の先行研究で、鼻粘膜のインピーダンスの測定によってin vivoでバリア機能をモニタリングする方法を報告している。鼻粘膜の電気的透過性についてアレルギー性鼻炎患者を対象に、Tissue Conductance Meter AS-TC100 (Asahi Biomed) を用いて鼻粘膜インピーダンスを測定し、印可電圧25mVおよび周波数320Hzで下鼻甲介前端の粘膜表面に電極を接触させることにより、一定電圧域から粘膜を介して検出電極に電流を流してインピーダンスを測定する方法で、鼻粘膜レベルでの炎症のグレードを評価し、得られた知見を学会で発表してきた。また、フィラグリンの局在を正常鼻副鼻腔粘膜の免疫染色によって検討し、下鼻甲介粘膜、蝶形骨洞粘膜の線毛上皮および基底細胞に同定した。また、一方でバリア機能破綻を来していると考えられている鼻茸組織検体での検討では上皮にフィラグリンは認めなかったことを報告した。さらに、MAC5ACとフィラグリンの二重染色を行い、鼻副鼻腔粘膜上皮においてgoblet細胞でのフィラグリン陰性反応も確認している。さらに正常ヒト鼻粘膜上皮細胞を培養し、回収した細胞をReal Time PCRを用いて測定し、鼻粘膜上皮におけるフィラグリンの発現を確認した。さらにタンパクレベルにおいてもフィラグリンの発現について培養正常ヒト鼻粘膜上皮細胞を用いて証明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 鼻副鼻腔粘膜におけるフィラグリン発現量の制御因子を探索するため、培養した正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に対して炎症性サイトカインおよびLL37、S100などの抗菌ペプチドを投与し時間依存的ならびに容量依存的な変化を無刺激のものと比較した。細胞はdish上でsubconfluenceに達したものを用い、Aurum Total RNA kitを用いてRNAを抽出し、High capacity cDNA RT kitを用いてcDNAを合成した上で、RT-PCR法にてプロフィラグリン及びフィラグリンのmRNAを7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems Inc.)と TaqMan gene Expression Assays で測定を行った。これにより鼻粘膜上皮におけるフィラグリンの発現の増強ないしは減弱傾向を示すと考えられる物質を確認した。さらにタンパクレベルにおいても正常ヒト鼻粘膜上皮培養細胞をSDS-PAGEによりゲル中で分離した後、ゲル内蛋白質をメンブレンに転写させ、ブロッティング後のメンブレンにフィラグリンの一次抗体で処理し、その後にHRP標識二次抗体を添加して検出を行い、フィラグリンタンパクの発現の変化を評価できた。これによってフィラグリンの増強因子を用いた新規治療戦略の解明が可能となってきた。さらに、バリア機能減弱に関連性が高いと考えられるアレルギー性炎症を客観的に評価するため、鼻副鼻腔手術にて摘出した下鼻甲介および鼻茸組織から免疫細胞をソーティングで分取して網羅的な遺伝子発現の検討を行った。まず組織からの細胞の分離法の確立および主要な免疫細胞の表面マーカーを用いた分取法の確立、ソート細胞からのRNA抽出法の確立、RNAのクォリティの確認・発現解析手法の確立、網羅的遺伝子発現解析を進めることができた。
Strategy for Future Research Activity	鼻粘膜上皮細胞におけるフィラグリン発現とバリア機能の関連をin vitroで評価するために、初代培養ヒト鼻粘膜上皮細胞バリア機能の変化について、上皮電気抵抗値(TER;trans epithelial electrical resistance)で評価する。インサート上に培養した細胞層を、インサート膜の上下にそれぞれ電極を置いて微小交流電圧(Vac)を加え、インピーダンスを測定し、抵抗が高ければバリア機能が強固であるといえる。また、バリア機能の指標となる輸送能についても、蛍光標識デキストラン(70kDa)の頂膜側から基底側への移動量を測定することにより検討する。この際にフィラグリン増強因子の容量依存的、時間依存的変化を確認する。またin vivoでの評価のために、Tissue Conductance Meter AS-TC100 (Asahi Biomed) を用いて鼻粘膜インピーダンスを測定しバリア機能を評価する。その上で、測定部位を摘出してフィラグリンを免疫染色およびReal time PCR、ウエスタンブロットによって評価して粘膜インピーダンスとの関連を評価する。また、これらを上皮の炎症があると考えられる疾患毎に検討することを目指す。
Causes of Carryover	スケジュールの調整がつかず予定していた学会への参加を断念したため。また、新型コロナウイルス流行による手術中止措置によりわずかに研究の遅れが生じた為、一部消耗品費の購入を次年度に見送った。短期的に研究の進捗状況を確認し、更に研究を遂行すべく実験に必要な消耗品を購入する。得られた研究成果を積極的に発表するため、旅費にも使用する。