内的酸化ストレスに惹起される角膜内皮細胞減少の分子機構解明と予防

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18360
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 尾内 宏美 東海大学, 医学部, 講師 (00580135)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 内的酸化ストレス / リポファジー / 角膜内皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでにミトコンドリア電子伝達系からスーパーオキサイド(O2・-)を過剰発生させるモデル動物（Tet-mev-1マウス）をもちいて、内的酸化ストレスに伴う角膜内皮細胞の減少を明らかにしてきた。しかし、その分子機序は不明であるため、本研究では内的酸化ストレスに伴う角膜内皮細胞減少の分子機序を明らかにすることを目的とし検討した。
昨年度までは、角膜内皮細胞のin vitro培養系を確立し、細胞レベルでの角膜内皮細胞の障害解析を行ってきた。細胞培養日数が経つにつれ、角膜内皮細胞が膨潤化し、さらに脂肪滴様の蓄積変化が認められた。昨年度の研究結果から、脂肪滴を選択的に分解するオートファジー（リポファジー：脂肪分解）の異常に伴う脂肪滴の出現（脂質の異常蓄積）が角膜内皮細胞の老化や細胞死誘導による細胞数の減少を引き起こしているのではないかと仮説し、今年度は角膜内皮の脂肪滴の出現を抑制するリポファジーの分子機構解明を中心に検討した。
角膜内皮の脂肪滴の出現を抑制するリポファジーの分子機構解明を検討するために、LC3（細胞質の可溶性タンパク質）抗体をもちいた免疫細胞染色と Westernblot、ならびにLipi-Green染色（生細胞内染色）を併用し、オートファゴソームと脂肪滴の局在化を確認し、リポファジーの有無を検証した。
LC3およびLipigreenによる免疫細胞染色では、若齢マウスでTet-mev-1マウスで標準マウスと比しLipigreenおよびLC3-IIが上昇しておりリポファジーが亢進していたが、老齢マウスでは逆に野生株と比しLC3-IIが減少していた。（老齢マウスのLC3-IIの定量およびLipigreenによる免疫組織染色は実験中）

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

酸化ストレスモデルマウス（Tet-mev-1マウス）の細胞培養の確立、若齢、高齢マウスにおけるin vitroでのオートファジーの解析まで行えており順調であるが、有力となった因子を標的にした薬剤をin vitroで実際に投与するところまでを昨年度中に行っておきたかったため、進捗状況としてはやや遅れを生じている。

Strategy for Future Research Activity

上記の研究結果から、内的酸化ストレスに伴うリポファジーの異常による細胞死が、角膜の老化現象の一つである角膜内皮細胞減少の分子機構の起点である可能性が示唆されている。
現在、角膜内皮細胞減少に伴う水疱性角膜症に対する治療には、TGF-β シグナルが活性化し、小胞体ストレスを生じさせ細胞死を引き起こすことが報告されているFuchs角膜内皮ジストロフィー患者でもちいられているRhoキナーゼ阻害剤の点眼が検討されている（文献:Okumura N et al.）。上記実験結果より有力となった因子を標的にした薬剤を実際に投与し、角膜内皮細胞減少を抑制できるか確認する。有力候補薬剤としてビタミンEやリスベラトロールといった微量栄養素を検討している。

Causes of Carryover

上記研究結果を海外学会で発表、参加する予定でいたが、COVID-19の影響で海外学会に参加することができなくなり、年度内完了が困難となった。
今年度の未使用残金は429,619円で、R4年度では、R3年度で行えなかった海外学会での発表を行う予定であるため、学会旅費等に使用予定。さらにマウス管理料、論文投稿料にも使用予定である。