p27kips1の成体ミュラー細胞における転写制御機構の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18361
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 須藤 則広 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80646216)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 網膜 / p27 / 転写制御 / ミュラー細胞

Outline of Annual Research Achievements

p27Kips1（以下、p27）は、細胞周期制御因子として細胞周期を離脱させる機能が知られているが、近年は転写制御因子としての可能性にも注目が集まっている。本研究では網膜のグリアであるミュラー細胞におけるp27遺伝子の機能について解析を行っている。p27は網膜前駆細胞で発現しており神経分化と共に減少するが、成熟網膜ではミュラー細胞においてその発現が強く維持されている。現在までにその機能は明らかではなく本研究において転写制御因子としての機能を明らかにしたいと考えている。よってp27の転写活性化能およびその標的因子を明らかにする必要があり、p27ノックアウトマウスと野生型マウスにおける遺伝子発現の比較ならびにクロマチン免疫沈降法による解析を計画した。
これまでの進行状況としてはリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析を行い、p27ノックアウトマウスと野生型マウスの網膜で炎症系マーカー遺伝子の発現が異なることが新たに分かった。これらに関してはその制御シグナル等の解析を現在行っている。また上記の結果を指標に網羅的に遺伝子発現の解析を行う為RNAシークエンス解析の準備を行った。本年度はそのサンプル採取、RNA抽出などを行いシークエンス解析（シークエンスのみ）に送った。また標的遺伝子解析を行う為p27ノックアウトマウスと野生型マウス網膜を用いたクロマチン調製を行い、免疫沈降を行えるように準備を整えた。今後これらの解析を進行することによりこれまで明らかになっていなかったp27遺伝子の転写調節因子としての現象をとらえることができると考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度はコロナウイルスによる大学の経営問題により約一か月間の一次帰休が行われ、さらに新校舎移転がほぼ一年間通して行われた為に研究の実施が遅れた。また緊急事態宣言時や感染等により出勤できない場合に備えマウスの飼育数も削減したことも大きく影響し、さらに物品等の購入も入荷に時間がかかるなど多方面からの影響があった。

Strategy for Future Research Activity

まず最優先で行うことは、p27ノックアウトマウスと野生型マウス網膜におけるRNA-seqによる遺伝子発現解析である。次年度にはデータが得られるのでその結果を基に解析の方向性や遺伝子の絞り込み等を行う予定である。本解析は本来ならばコンディショナルノックアウトマウスで行う予定であったが、コロナウイルスによる飼育数の削減や校舎移転に伴う実験動物飼育室の一時閉鎖があり、時間と必要なライン数が多くなるコンディショナルノックアウトによる実験は困難と判断した。そこでこれまでも使用実績のあるp27ノックアウトマウスに切り替えて行った。このマウスは全ての細胞でp27が欠損しているが、遺伝子発現等の変化は抗体染色等を行えばミュラー細胞特異的に特定できる。続いてクロマチン免疫沈降法（ChIP-seq解析）をp27遺伝子に対して行い、p27の標的遺伝子がRNA-seqの結果と一致するか検討を行う予定である。

Causes of Carryover

本年度は新校舎移転による引越しとコロナウイルスの影響により実験に遅延が生じた。
繰り越し予算はChIP-seqやRNA-seq、並びに試薬、消耗品、実験動物など予定に合わせて使用する。