2022 Fiscal Year Research-status Report
p27kips1の成体ミュラー細胞における転写制御機構の解析
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20K18361
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
須藤 則広 東邦大学, 医学部, 助教 (80646216)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 網膜発生 / 転写制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
p27Kip1（以下、p27）遺伝子は、細胞周期制御因子として細胞が細胞周期から離脱することを制御している。しかし近年は細胞周期制御因子としての機能以外に転写制御因子としての可能性についても注目が集まっている。本研究では網膜のグリアであるミュラー細胞のp27遺伝子の機能について解析を行っている。発生期の網膜前駆細胞でp27遺伝子が発現すると増殖が停止し、その後神経分化へと進む。成熟した網膜の神経細胞ではp27遺伝子の発現は減少するが、なぜかミュラー細胞においては強く維持されている。現在までにその機能は明らかではなく本研究において転写制御因子としての可能性を追求している。
昨年度p27遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスを用いて網膜におけるRNAシークエンス解析を行い、網羅的な遺伝子変動について調べたが、本件度はさらにゲノムや解析法を変えて再解析を行った。さらにミュラー細胞に対するp27遺伝子のクロマチン免疫沈降シークエンス解析も合わせて進行中である。
網膜を用いたRNAシークエンスの再解析では前回の解析同様に発現が上昇する遺伝子が多くみられた。またp27遺伝子ノックアウトマウスの網膜では外境界膜が壊れる形態的特徴が知られているが、これと関連し細胞を密接に繋ぐタイトジャンクション遺伝子が大きく減少している可能性が示された。さらにp27遺伝子ノックアウトマウスの網膜では錐体細胞が減少していることが報告されているが、RNAシークエンスでも同様の結果が得られた。錐体細胞変性に伴う、炎症応答・保護作用に関連した多くの遺伝子の上昇が確認された。p27遺伝子ノックアウトマウスの網膜では他の網膜変性マウスと同様に視細胞の保護作用が働いていると考えられる。従ってp27遺伝子ノックアウトマウスが新たな遺伝的な網膜変性マウスである可能性を示すものであるといえる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クロマチン免疫沈降シークエンス解析の為のクロマチン調整を当初は網膜組織全体から行っていたが、ミュラー細胞の割合が低く、p27遺伝子の発現量も少ないことから難航していた。対策として磁気ビーズを用いた細胞分離によりミュラー細胞が濃縮され問題が解決された。ただそれでも免疫沈降されるDNA量が通常よりも少ないため、検討の結果クロマチンの調整方法等も変更し、微量サンプル用の免疫沈降キットとライブラリーキットの使用により何とかシークエンス解析に持ち込めることが分かった。それらサンプルを用いてミュラー細胞におけるp27遺伝子のクロマチン免疫沈降シークエンス解析を進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究ではp27遺伝子が細胞周期制御以外に、転写制御領域に結合し転写調節に関わることを明らかにすることを目的としている。その為p27タンパク質のゲノム領域への結合を見るためにクロマチン免疫沈降シークエンス解析を進めている。網膜組織より磁気ビーズによるミュラー細胞の分離を行い、再現性を担保する為に2種類のp27抗体を用いてそれぞれ解析を行っている。さらに転写調節領域であることを示すために、ヒストン修飾との関連性を示したいと考えている。これらについてもクロマチン免疫沈降シークエンス解析を行う予定である。p27遺伝子はDNA結合ドメインを持たないと考えられているので、何らかのDNA結合性因子（転写調節因子）を介してゲノムに作用していると推測している。そこでクロマチン免疫沈降シークエンス解析のピーク情報より得られるコンセンサス配列を用いて、共役している因子を絞り出し、p27タンパク質との結合性を確認する予定である。さらに転写活性に与える影響を評価する為に培養細胞を用いたレポーターアッセイを行う予定である。RNAシークエンス解析から、p27ノックアウトマウスでは発現が上昇する遺伝子が多いことから、p27遺伝子は転写抑制に関わっていると推測している。次にクロマチン疫沈降シークエンス解析とRNAシークエンス解析の結果から遺伝子の変動の関連付けを行う予定である。また外境界膜の変異についてはタイトジャンクション遺伝子をノックダウンすることで外境界に膜影響が見られるかどうか検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
１．実験上の予期しない問題への対応の為
２．様々な社会情勢により試薬や物品入荷等に時間を要した為
使用計画は当初予定通りシークエンス解析や抗体や精製キットの購入費、論文投稿、学会発表などに使用予定。
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