2021 Fiscal Year Research-status Report
hiPS細胞シングルセル蛍光イメージングによる眼発生初期のRAX遺伝子の機能解明
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20K18380
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
小林 礼子 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (10857874)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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Keywords | ヒトiPS細胞の遺伝子組み換え |
Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞で眼の発生を模倣するSEAM法を基盤技術として、眼の発生初期に発現する転写因子RAX遺伝子の生理学的な機能を詳細に解明するために研究を行っている。 具体的には、RAX発現細胞を可視化してその細胞の挙動を追跡できるようなイメージングシステムの樹立、RAX遺伝子ノックアウト細胞の樹立、そしてそれらの細胞を用いて、RAX発現細胞と関連する眼発生ネットワークの解析を行うことを目標としている。 ①CRISPR/Casシステムを用いて、RAX遺伝子の発現に伴い蛍光蛋白質を発現する遺伝子組み換えヒトiPS細胞の樹立を試みている。組み換え用ベクターとCas gRNAベクターの作製し、トランスフェクション後の細胞の薬剤選択を行うことで目的の細胞の獲得を目指している。得られたクローンのgenotypingを行うと、ノックインが行えていなかったり、異所性にノックインされてしまっていることが多く、これまでに8種類の異なる配列のgRNAベクターを作製し、遺伝子組み換えを試みている。 ②①において遺伝子組み換えiPS細胞の獲得に至らないため、遺伝子組み換えのコンストラクトを変えたベクターの作製に着手している。①と並行して行っており、いずれかのコンストラクトで遺伝子組み換えが起こった方を用いて続きの実験を行う予定である。 ③①の遺伝子導入時に、遺伝子組み換えが起こらず遺伝子修復過程でエラーが入ってRAXがノックアウトされた細胞が理論的には混ざるため、その細胞を単離してRAXノックアウト時の眼の発生異常の解析につなげようとしている。現在48個の候補クローンを得ており、これらのgenotypingを今後行っていく予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子組み換えが起こりにくく、目的の遺伝子改変iPS細胞の樹立に難渋している。gRNA配列を変えたり、導入遺伝子のコンストラクトを変えるために、ベクターのクローニングにもそれぞれ時間を要している。
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Strategy for Future Research Activity |
①RAX発現細胞を可視化できる遺伝子組み換えiPS細胞が得られた後には、SEAM形成を行い、眼の初期の発生においてその細胞がどのような挙動を示すのかをタイムラプス顕微鏡で継時的に観察していく。 ②①の遺伝子組み換え中に得られるRAX遺伝子ノックアウトヒトiPS細胞を単離し、SEAMの発生に与える影響を観察する。 ③SEAM形成初期におけるRAXやその他の眼の発生に関連する遺伝子の発現解析を行う。
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Causes of Carryover |
今年度はレポーター遺伝子を導入したiPS細胞の樹立が完了しなかったため、蛍光顕微鏡を用いたタイムラプス観察を行わず、物品費の一部として請求した交換用ランプの購入を行わなかった。 次年度には、現在委託して作製している新規コンストラクトのベクターに対する支出や、蛍光顕微鏡のランプの購入があることから、翌年度分の助成金と合わせて使用する計画としている。
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