2020 Fiscal Year Research-status Report
Endo180が角膜実質細胞におけるコラーゲン収縮能に果たす役割
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20K18401
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
高橋 彩 近畿大学, 大学病院, 講師 (70460889)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Endo180 / 角膜実質細胞 / コラーゲン受容体 / 角膜創傷治癒 / αSMA / uPA / integrin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
角膜は水晶体とともに光の屈折を担う組織であり、視力の維持のためには透明であることが重要である。外傷や感染などで角膜実質が障害されるとしばしば不可逆的な混濁をきたすことがある。角膜実質創傷治癒過程において角膜実質細胞は筋線維芽細胞へ形質転換することにより、瘢痕形成や組織収縮に重要な役割を果たす。そのため角膜実質細胞の筋線維芽細胞への形質転換を制御することは角膜の透明性を保つうえで重要であると考えられる。
また角膜実質細胞とコラーゲンとの相互作用は、角膜実質細胞の筋線維芽細胞への形質転換にも関与しており、角膜実質細胞に発現している種々のコラーゲン受容体の作用を解明することは重要であると考えられる。
Endo180は、主に間葉系細胞に発現するマンノース受容体ファミリーのひとつであり、断片化したコラーゲンの細胞内への取り込みやコラーゲンへの細胞接着、また細胞移動の促進などに関与する。これまでの報告では角膜実質とEndo180の関係を検討した報告はなく、角膜実質における発現やその機能を検討することは角膜実質の瘢痕形成や組織収縮のメカニズムを考える上で重要な手がかりとなる可能性がある。
そこで本研究では、角膜実質におけるEndo180の役割を明らかにすることを目的とし、生体角膜により近いモデルとして、角膜実質細胞をコラーゲンゲル内で培養し、コラーゲン受容体のひとつであるEndo180が角膜実質細胞の筋線維芽細胞への形質転換やコラーゲン収縮能にどのような影響を与えるかを検討して、角膜創傷治癒過程における瘢痕形成や組織収縮の抑制に対する臨床応用を目指して研究を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は下記について明らかとなった。
１）Endo180がコラーゲンゲルの収縮能に及ぼす影響について検討した。マウス角膜実質細胞をコラーゲンゲル内で三次元培養し、抗Endo180抗体を濃度別に、また、コントロールとしてウサギ血清をコラーゲンゲル上に添加したのち、ゲルの直径を測定して、ゲルの収縮率を検討した。その結果、抗Endo180抗体濃度依存的にコラーゲンゲルの収縮は抑制された。
２）Endo180が角膜実質細胞の筋線維芽細胞への形質転換に及ぼす影響について検討した。コラーゲンゲル内にマウス角膜実質細胞を培養し、抗Endo180抗体を添加してWestern-blot法によりαSMAの発現量を検討した。その結果、抗Endo180抗体はαSMAの発現には影響を与えなかった。
３）Endo180が角膜実質細胞のコラーゲン分解に及ぼす影響について検討した。マウス角膜実質細胞をコラーゲンゲル内で培養し、抗Endo180抗体を加えて培養上清中のヒドロキシプロリンの量を測定した。その結果、抗Endo180抗体の有無により、コラーゲン分解能には有意な差を認めなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Endo180はuPAの存在下でuPA受容体と複合体を形成することが明らかになっている。また、uPAはuPA受容体と結合し、integrinの発現や作用を調節することが知られている。
そこで、令和3年度は、uPAに関連した膜タンパクであるEndo180、uPAR、integrinβ1を標的とし、これらの受容体がuPAの作用により、角膜線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換にどのような影響を与えるのかを検討する。このために、uPA遺伝子欠損マウス（uPAKO）とその野生型マウス（uPAWT）の角膜線維芽細胞を使用する。uPAKOおよびuPAWTの角膜線維芽細胞を1型コラーゲンゲル内で一定期間培養し、α-SMAの発現を免疫細胞染色および、real time RTPCR法、western blot法により評価する。また、SMAD3のリン酸化についても検討する予定である。
また抗Endo180抗体、抗uPAR抗体、抗integrin β1抗体を培養上清に添加して、これらの受容体がα-SMAの発現にどのような影響を与えるか、そのメカニズムについても検討する予定である。
さらにuPAWTとuPAKOのマウスに非穿孔性角膜切開を加えて、Endo180、uPAR、integrin β1、α-SMAの発現を組織免疫染色を用いて経時的に評価し、角膜実質の創傷に対するEndo180、uPAR、 integrinβ1の発現に、uPAがどのような影響を与えるかについても合わせて検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた細胞の培養液の購入費が少なく済んだため。令和3年度にピペット類を購入する予定である。
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Research Products
(1 results)
