羊膜由来間葉系幹細胞を用いた糖尿病足病変の感染制御

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18406
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 北條 正洋 北海道大学, 大学病院, 医員 (80866666)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / 羊膜 / 再生医療 / 糖尿病性潰瘍 / 創傷治癒

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病性足病変は糖尿病患者の下肢に生じる感染、潰瘍、深部組織の破壊性病変とされ、難治性で予後不良である。一方、間葉系幹細胞は様々なサイトカインを産生し、血管新生作用、抗炎症作用、神経再生促進作用など、創傷治癒を促進する作用を持つが、細菌増殖を抑える効果も報告されており、感染制御にも有用と考えられる。間葉系幹細胞は骨髄、脂肪、胎盤(羊膜)などから樹立できるが、通常分娩後に廃棄される胎盤からは侵襲なく幹細胞を大量に採取することが可能である。また胎児由来の幹細胞であるため細胞機能が高く、より大きな効果が期待できる。本研究は、羊膜由来間葉系幹細胞が糖尿病足病変の感染を制御するか、動物モデルを用いて検証することを目的とした。
初年度では、糖尿病マウスの背部に全層皮膚欠損創を作製し、幹細胞含有ゲルを外用することで創傷治癒が促進することを明らかにした。
本年度はまず細菌の選定から行った。感染性糖尿病潰瘍モデルマウスを用いた先行研究を参考とし、それらで多く用いられていた黄色ブドウ球菌株を用いることとした。
次に細菌を購入し、培養と細菌量の調製に着手した。固体培地で24時間培養した後に液体培地で36時間の振盪培養を行い、濃度を調製し吸光度1の細菌懸濁液を作成した。これを10倍ずつ10分の1から1億分の1まで段階希釈を行い、その後にそれぞれを固体培地で24時間培養し、吸光度と細菌数の関係を明らかにした。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

我々が作成した糖尿病性潰瘍モデルにおいて、非糖尿病モデルに比べ創傷治癒が遅延することが確認できた。また羊膜由来間葉系幹細胞を含有するゲルが、糖尿病モデルの創傷治癒遅延を改善することが明らかとなり、感染創における創傷治癒も改善する可能性が期待できる。現時点では細菌の培養及び、細菌濃度の調整を行った。
しかしながら、実験に適当な細菌の選定や購入に時間を要した。また、細菌購入後も細菌の吸光度とCFUの関係の把握や培養曲線の作成など、本実験を行うにあたっての細菌の特性把握や条件設定に時間を要したため、モデルマウスの作成に至らなかった。当初2カ年計画であったが研究が遅れており、1年延長して検証を行う方針である。

Strategy for Future Research Activity

本年度獲得した手法に基づき、黄色ブドウ球菌の細菌濃度を調整する。糖尿病マウスに潰瘍を作製し、潰瘍底に細菌を投与して感染性糖尿病潰瘍モデルを作製する。幹細胞培養上清を含んだゲルを潰瘍に外用し、局所および全身の感染兆候について、コントロールゲル外用群と比較する。潰瘍部皮膚および皮下組織、筋を一塊に採取し、病理組織学的検討を行う。HE染色で病原菌の有無や数、局在を確認し、免疫染色ではMPOやF4/80、CD3抗体等を用いて好中球やマクロファージ、リンパ球の浸潤の程度を比較する。採取した組織の一部からmRNA抽出を行い、感染制御や炎症などに関わる因子の遺伝子発現(TGF-β、IL-4など)をreal time PCRで検討する。

Causes of Carryover

本年度より細菌を購入し、培養を開始した。感染モデルマウスを作成する予定であったが、細菌の培養手技および細菌懸濁液の濃度調製に時間を要したためモデルマウス作成に至らず研究期間を延長した。
今後は感染性糖尿病潰瘍モデルマウスの作成、創部の評価を行う予定であり、動物購入費用および飼育・ 管理費用、抗体購入費用に充てる予定である。