the role of HMGB1 in autophagy of malignant melanoma

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18438
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 松本 麻由 愛媛大学, 医学部附属病院, 助教(病院教員) (20844765)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 悪性黒色腫 / Autophagy / HMGB1

Outline of Annual Research Achievements

正常ヒト角化細胞を用いた単層培養細胞を用いて、正常細胞サイクル内でのautophagyを各種抗体（ATG5, ATG12, Beclin1, LC3B,など）を用いた免疫蛍光染色法で観察した。細胞数がsub-confluenceの状態ではATG5, ATG2の活性化がみられたが、full confluenceになると活性化が下がる傾向にあった。また、三次元培養表皮(Living skin equivalent; LSE)を用いて、同様の免疫染色を行ったところ、基底層ではATG5の活性化がみられた。同様の抗体を用いてWestern blotでも同様の結果を確認できた。
次に単層培養細胞に対し、HMGB1の拮抗薬であるHMGB1 A-boxを投与し、Autophagyの抑制がみられるかどうか、免疫抗体染色法、Western blotを用いて確認したが、明らかな抑制効果が見られなかった。これは投与するHMGB1 A-boxの濃度や投与法に問題があると考えられたため、トランスフェクション試薬（Lipofectamin3000）を用い、どのような条件下で（濃度、時間など）、蛍光マーカーを付与したHMGB1 A-boxが細胞内への確実な取り込みが行わるかどうか、傾向顕微鏡のタイムラスプ機能を用いて観察・検討中である。
これに平行してヒト悪性黒色腫の原発巣または転移巣より分離した細胞株を培養し、継体する予定であったが、コロナ下での研究制限があり当院臨床研究倫理審査委員会への申請段階で待機している状況である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ下での研究制限のため、悪性黒色腫患者より細胞株を採取するための、倫理委員会への申請が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き角化細胞の単相培養細胞に対して、HMGB1 A-boxによるAutophagyの抑制実験を行う。また、ヒト悪性黒色細胞の採取が困難である場合、代替案として、市販のマウスの悪性黒色腫細胞株を入手して研究計画を遂行する予定としている。今後マウスの角化細胞にも同様の実験を行い、悪性黒色腫腫細胞株における結果との比較を行う。

Causes of Carryover

新型コロナ感染症流行により、学会参加のための旅費などの使用が必要なかったため。
使用計画としては、可能であれば学会参加費として使用し、また、実験用マウスなどの購入費に充てる予定である。