the role of HMGB1 in autophagy of malignant melanoma

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K18438
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 松本 麻由 愛媛大学, 医学部附属病院, 助教(病院教員) (20844765)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 悪性黒色腫 / Autophagy / HMGB1

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は悪性黒色腫の腫瘍細胞内でのAutophagyのメカニズムを明らかにすることである。まず、正常ヒト角化細胞を用いた単層培養細胞を用いて、正常細胞サイクル内でのautophagyを各種抗体(ATG5、ATG12、Beclinl、LC3B、など)を用いた免疫蛍光染色法で観察した。細胞数がsub-confluenceの状態ではATG5、ATG2の活性化がみられたが、full confluenceになると活性化が下がる傾向にあった。また、三次元培養表皮(Living skin equivalent;LSE)を用いて、同様の免疫染色を行ったところ、基底層ではATG5の活性化がみられた。同様の抗体を用いてWestern blotでも同様の結果を確認できた。
次に単層培養細胞に対し、HMGB1の拮抗薬であるHMGB1 A-boxを投与し、Autophagyの抑制がみられるかどうかを調べた。まず、トランスフェクション試薬(Lipofectamin3000)を用い、蛍光マーカーを付与したHMGB1 A-boxが細胞内への確実な取り込みが行われるかどうか、蛍光顕微鏡のタイムラスプ機能を用いて観察・検討を行ったところ、投与後短時間(5-10分)で細胞内に取り込まれる様子が確認された。しかし、免疫抗体染色法、Western blotを用いて確認した結果、HMGB1 A-box投与によりautophagyの明らかな抑制効果は見られなかった。ヒト悪性黒色腫の原発巣または転移巣より分離した細胞株で検討を行ったが、同様の結果であった。
このことからHMGB1の拮抗薬とされるHMGB1 A-boxは、HMGB1が誘導するとされるautophagyの抑制効果は示さないことが確認された。