Rab44の破骨細胞分化制御機構及び骨組織に対する影響の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K18459
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 山口 優 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (50823308)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Rab44 / Rab GTPase / 破骨細胞 / Rab44ノックアウトマウス / 骨組織解析

Outline of Annual Research Achievements

極性小胞輸送がどのように破骨細胞分化制御に関わっているかを明らかにするため、Rab44と結合するタンパク質の同定を免疫沈降法にて行った。Rab44とともに沈降してきたタンパク質を質量分析器にかけ、Coronin1Cを同定した。Coronin1Cは不活性型のRab44と主に結合していることも明らかになった。一分子単位での結合を確認できるPloximity Ligation実験においても同様に結合が確認された。また、マウス骨髄由来破骨細胞前駆細胞の共焦点顕微鏡での観察でも、Rab44とCoronin1Cの共局在性が認められた。
Rab44ノックアウトマウスを用いての大腿骨、脛骨のマイクロCT解析、及び大腿骨、脛骨の骨髄由来破骨細胞培養を行なった。マイクロCT解析の結果、Rab44ノックアウトマウスでは海綿骨の骨梁間隔の拡大傾向が認められたが、有意な差は得られなかった。骨髄由来破骨細胞の解析では分化程度を確認するため、TRAP染色を行った。その結果、Rab44ノックアウトマウスでは破骨細胞数の増加と巨大化が見られた。また、骨髄由来破骨細胞のmRNAを回収し、リアルタイムPCRで破骨細胞分化マーカーの遺伝子発現程度を見てみると、ノックアウトマウスでの発現量の上昇が認められた。次に骨吸収能力を見るためにosteo assay plate上で骨髄由来破骨細胞の培養を行なった。その結果、骨吸収面積はノックアウトマウスで増加することがわかった。骨髄由来破骨細胞を各種細胞内オルガネラマーカーで蛍光免疫染色し共焦点顕微鏡で確認したところ、ノックアウトマウスでゴルジ体のマーカーであるGM130の核周囲の膜上集積が認められた。以上の結果は以前、代表者の報告していた、Rab44ノックダウン細胞での結果と一致している。