歯根嚢胞モデルマウスの確立と治療法開発に向けた発症・成長メカニズムの解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18462
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 熊上 深香 (坂野深香) 岩手医科大学, 歯学部, 常任研究員 (30710826)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞・組織 / 歯学 / 歯の発生 / 細胞遊走 / 歯根嚢胞

Outline of Annual Research Achievements

前年度、本研究は歯根嚢胞の形成メカニズムに関する研究を進めた。歯根嚢胞は、根尖の慢性炎症に起因したヘルトヴィッヒ上皮鞘（HERS）あるいはマラッセ残存上皮の増殖による歯原性嚢胞と考えられているが、嚢胞発生に関わる上皮細胞の特性は十分に理解されていない。そのため、HERSやERMの形成メカニズムを理解することが病因解明につながると考える。これまでは、HERSの上皮シートがアポトーシスや上皮間葉転換を起こし、”断裂“してERMを形成するという仮説が存在していたが、我々は、HERSを構成する細胞（外エナメル上皮）が遊走・離脱して、ERMを形成するのではないか、このメカニズムにEMTが関与しているのではないかと考えた。そこで、HERSからERMが生じるメカニズムの仮説として、TGF-βによるEMTがHERSの断裂と遊走を調節するメカニズムの一つであることから、①細胞骨格制御に関わるRhoシグナルの低下がHERS細胞のEMTに関連していること②Rhoシグナルの制御にTGF-βが関係していること③TGF-βの活性化制御に歯根膜線維が関係していること を想定した。また、歯根嚢胞が生じるメカニズムの仮説として、①炎症環境下で歯根膜線維が破壊され、②歯根膜（フィブリリン）にトラップされていたTGF-βが放出され、③HERSやERMのRhoシグナルの低下が起こり、④細胞遊走し、肉芽の中に散在し嚢胞を形成する と考え、実験を行った。そこで、HERSからERMが形成される過程が上皮間葉転換によるものであることを証明する（発生学的検索）、Rhoシグナルの低下によりHERSが上皮間葉転換を起こし、嚢胞を形成することを証明する（病因検索）ことを目的に、歯根と歯周組織の発生メカニズムの解明や歯根嚢胞の形成メカニズムの一端を明らかにすること、マウス顎骨嚢胞形成モデルの作成を目指した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.HERSからERMが形成される過程が上皮間葉転換によるものであることを証明するために、周囲細胞との相互作用によるHERS02T細胞の機能解析(in vivo)を行なった。HERS細胞株(HERS02T)と歯根膜細胞株（MDF）とを組み合わせた細胞塊をヌードマウスに移植し、得られた組織構造物を解析した。さらに、これらの細胞塊とROCK阻害剤, TGF-β, 炎症性サイトカイン等を徐放させながら，これらの因子が組織形成に与える影響を評価した。その結果、HERS02TとMDFの組み合わせでは、上皮細胞はマラッセ様に集塊を形成し、上皮細胞塊の周囲に骨様基質が形成された。骨様基質は上皮塊と線維性結合組織を介して形成されていた。HERSのみの場合では、散在していた上皮細胞は経時的に集まり広範囲で細胞の集団を形成し、マラッセ様の集塊、嚢胞に類似した隔壁様の構造、骨様基質が形成されていた。骨様基質は上皮塊と一定の距離をもって形成されていた。
2.Rhoシグナルの低下によりHERSが上皮間葉転換を起こし、嚢胞を形成することを証明するために、Tgマウスを用いたHERS・ERM形成におけるRhoシグナルの役割の解析を行なった。タモキシフェン誘導型RhoA dominant negative form Tgマウスの上下顎骨を採取し、パラフィン切片を作製し、歯根発生過程におけるマウス大臼歯でのHERS, ERMの構造異常,それに起因する嚢胞様構造物の有無やフェノタイプの変化（細胞数の変化や細胞配列の乱れ等）を組織学的に観察した。
その結果、RhoA D/N(+)ではRhoA D/N(-)に比べ、HERSの細胞の連続性がなく、ERMの数が少なく、歯根象牙質幅が薄く、有細胞セメント質の形成量も少なかった。さらに、嚢胞様構造物は見られず、セメント質の中に上皮細胞マーカーの発現が観察された。

Strategy for Future Research Activity

1)Tgマウスを用いた、HERS・ERM形成におけるRhoシグナルの役割の解析:タモキシフェン誘導型RhoA dominant negative Tgマウスの上下顎骨を採取し、パラフィン切片を作製する。歯根発生過程におけるマウス大臼歯でのHERS, ERMの構造異常,それに起因する嚢胞様構造物の有無やフェノタイプの変化（細胞数の変化や細胞配列の乱れ等）を組織学的に観察する。
2)周囲細胞との相互作用によるHERS02T細胞の機能解析(in vivo):HERS細胞株(HERS02T)と歯根膜細胞株（MDF）とを組み合わせた細胞塊をヌードマウスに移植して、得られた組織構造物を解析する。さらに、これらの細胞塊とROCK阻害剤,TGF-β, 炎症性サイトカイン等を徐放させながら、これらの因子が組織形成に与える影響を評価する。これらの実験により、Tgマウスでは歯根発生異常や嚢胞様構造物が見られ、細胞移植ではHERSとMDFの相互作用により嚢胞様構造物や骨様構造物を形成すると考えられる。
3)RhoシグナルとEMTに関連する各種マーカータンパク質の発現の解析：1)の実験系を継続し、Tgマウスおよび細胞移植マウスの解析を行う。Rhoシグナルに関わり上皮機能の維持に関連する各種タンパク質（Paxillin,Sema4D,PlexinB1,Ovol2等）の発現とEMTに関連するマーカーの発現量を免疫組織学的に解析する。
4)周囲細胞との相互作用によるHERS02T細胞の機能解析(in vitro)：HERS02Tおよび MDFをサイトカイン等を添加した条件で共培養しHERSO2Tの細胞形態や遊走能などの機能変化を観察する。以上の実験より、HERSのEMTに関わるシグナル経路が明らかになる。歯根嚢胞の病態形成に関与が考えられる因子について、その作用を阻害する薬剤を用いたRescue実験を計画する。

Causes of Carryover

昨年度は新型コロナウイルス(COVID-19)感染症の世界的感染拡大により、国内外での学会がWEB開催となったため、交通／宿泊費として計上していた費用が使用されなかった。次年度の使用計画としては、タンパク質の発現解析に使用する試薬、免疫組織学解析に用いる抗体、歯根嚢胞の病態解析に用いる阻害剤など、次年度の実験を遂行するために必要な物品経費として使用する予定である。