歯周病と非アルコール性脂肪肝炎における新規バイオマーカーの検討

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18519
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 大野 祐 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (80824151)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 歯周炎 / NASH / ANGPTL2 / 慢性炎症

Outline of Annual Research Achievements

1.実験的歯周炎モデルマウスの作成
12週齢の NASHモデルマウス（C57BL/6J-NASH）を用い、上顎第二大臼歯に 5-0絹糸を留置することより炎症を惹起させ、実験的歯周炎モデルとする。また炎症状態長期化のため片側２週間絹糸の留置を行い、計４週間歯周炎状態を維持する。なお擬似処置を行ったNASHモデルマウスを対照群とする。実験的歯周炎惹起後、４週間ごとに体重測定、μ-CTを用いた歯槽骨吸収の解析ならびに尾静脈から採血を行う。16週齢にて屠殺後、歯周組織、肝臓を採取し以下の実験に用いる。
凍結包埋にて歯肉における連続切片を作製し、組織染色を用いて炎症性細胞浸潤および ANGPTL2の局在を病理組織学的に評価する。この結果より、歯周炎の惹起による歯周組織局所におけるANGPTL2タンパク産生量を可視化して評価する。パラフィン包埋にて肝臓の組織切片を作成し、NASHの病態確認および肝臓でのANGPTL2の局在を確認するため、肝細胞の線維化、風船化、炎症性細胞浸潤などの病理組織学的評価を行う。次に、肝臓組織の一部を gentle MACSを用いてホモジナイズし、NucleoSpin RNA II systemを用い total RNA抽出を行う。その後、Reva-tra ACEを用いて、cDNAに逆転写を行う。そして、①ANGPTL2の遺伝子発現量を Real-time quantitative PCR (qPCR)法で測定する。②高発現しているその他の遺伝子を網羅的に解析するため、PCR Array Kit (RT2 Profiler PCR Arrray)を用いて、NASH病態における肝臓組織の遺伝子発現を網羅的に解析する。これらの結果より、肝臓局所における ANGPTL2の遺伝子発現の変化を確認するとともに、歯周炎がNASHの病態形成に影響を与える因子を同定する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実験的歯周炎を起こしたNASHモデルマウスの血液サンプル数を増やし、血中のANGPTL2濃度解析を行っている。また投稿準備において、当初計画よりも実験内容を増やして対応している。

Strategy for Future Research Activity

現在の得られたデータに加えて、ANGPTL2リコンビナントタンパク質を腹腔内投与した際のNASH病態の変化を確認する。また肝臓組織の病理学的解析及び遺伝子解析を行う。論文投稿は Journal of Dental Researchに行う予定である。

Causes of Carryover

論文投稿が遅れ、英文校正および追加実験分の費用の執行が遅くなっている。今後は論文投稿を行い、リバイスに対応できるよう追加実験を行う。