過分極活性化環状ヌクレオチド依存性チャネルは神経障害性疼痛にどのように関与するか

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18695
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 三宅 沙紀 岡山大学, 大学病院, 医員 (40869393)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: HCNチャネル / 神経障害性疼痛 / 抗炎症作用

Outline of Annual Research Achievements

神経障害性疼痛は慢性的な痛みとなり、生活の質を低下させます。近年、神経障害性疼痛に対する全く新たな治療薬として、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性(HCN)チャネル阻害薬が注目されています。一方、神経障害性疼痛は、直接的な神経損傷の時だけでなく、炎症が関わっていることが報告されています。本研究代表者はHCNチャネル阻害薬に抗炎症作用があることを発見しましたが、これがどのように痛みの制御に関与しているかはまだ解明できていません。そこで、動物実験および培養した細胞で、HCNチャネル阻害薬による抗炎症作用が、どのように痛みを抑えているかを調べました。
本年度は、動物モデルを用いてHCNチャネル阻害薬ivabradineを投与し、炎症性メディエータへの影響を検証しました。その結果、ivabradineによって炎症性メディエータであるTNFαの産生が抑制されることが示されましたが、COX-2への影響は明らかではありませんでした。一方、forskolinによってivabradineのTNFαの産生への効果に影響はありませんでした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

動物モデルを用いてHCNチャネル阻害薬ivabradineを投与し、炎症性メディエータへの影響を検証した。ラットの後肢足蹠を用いて、1%carrageenan溶液0.05mLを皮下注射し、局所炎症を誘発し、1%carrageenan溶液にHCNチャネル阻害薬ivabradineを添加し、さらにHCNチャネルを活性化させる試薬（forskolin: FSK）を添加した。２時間後に足蹠組織を採取し、切片を作製して免疫染色した結果、ivabradineによって炎症性メディエータであるTNFαの産生が抑制されることが示されたが、COX-2への影響は明らかではなかった。一方、FSKによってivabradineのTNFαの産生への効果に影響はなかった。FSKはHCNチャネルサブタイプのうちHCN2とHCN4を活性化することが知られているため、HCNチャネル阻害薬ivabradineの抗炎症作用がFSKの影響を受けなかったことから、HCN2およびHCN4以外のサブタイプが関与している可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

HCNチャネル阻害薬ivabradineによる抗炎症作用の機序について検索するために、RAW264.7細胞を用いてin vitro実験を行う。大腸菌O55:B5由来のリポ多糖類(LPS)を最終濃度10ng/mLでRAW264.7細胞を刺激し、ivabradineを最終濃度50μMで投与する群、およびLPSにivabradineを添加する群、HCNチャネルを活性化させる試薬(forskolinなど)群に分け、試験薬投与6時間後に細胞を回収する。RNAを抽出およびcDNAを合成し、cDNAを試料としてリアルタイムPCRを行い、炎症性メディエータ(TNFα, COX-2 など)およびHCNチャネルサブタイプの遺伝子(mRNA)発現量を定量する。さらに、HCNチャネルサブタイプのうち、どのサブタイプが抗炎症に関与しているかをsiRNAを導入して、サブタイプ遺伝子をノックダウンし、抗炎症効果への影響を評価する。

Causes of Carryover

今年度は動物実験を行い、実験の実施について、当初の見積額よりも安価に実施できた。次年度は分子生物学的実験を実施し、高額な費用が必要なため次年度に使用する。