2021 Fiscal Year Research-status Report
マトリックスメタロプロテアーゼに着目したドライマウス治療の開発研究
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20K18697
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小野 信二 徳島大学, 病院, 医員 (60770576)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ドライマウス / MMP-9 / CXCL10 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ドライマウスの原因として唾液腺腺房構造の破壊が挙げられるが、その詳細な分子メカニズムは解明されていない。研究代表者は加齢ドライマウス患者およびシェーグレン症候群（SS）ドライマウス患者の唾液中に、蛋白分解酵素である Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) が有意に増加していることを発見した。本研究では、ドライマウス病態形成における MMP-9 過剰発現の分子機構を原疾患別に解明し、病因に対応したドライマウス治療の確立を目指すことを目的とする。
ヒト唾液腺細胞株を用いてMMP-9過剰発現に影響を与えるサイトカインを同定することにした。当科で樹立した正常ヒト唾液腺腺房細胞株(NS-SV-AC)および導管細胞株 (NS-SV-DC)に種々のサイトカイン(IFN-α,IFN-γ,TNF-α,IL-1β)を添加し、MMP-9 mRNA発現をRT-qPCRで解析した。無刺激の状態では、MMP-9 mRNA発現レベルは、NS-SV-AC細胞に比較してNS-SV-DC細胞で有意に高かった。NS-SV-DC細胞では、IFN-α,TNF-α,IL-1β刺激によりMMP-9 mRNAの発現亢進を認めた。次に、MMP-9とケモカインCXCL10の関連を調べるために、MMP-9制御が導管細胞のIFN-γ誘導性CXCL10発現に及ぼす影響を調べた。先行実験で特定されたサイトカインでNS-SV-DC細胞刺激後に MMP-9 阻害薬 (Merk社) を添加し、CXCL10 の発現を RT-qPCR および ELISA で測定した。その結果、MMP-9阻害によりNS-SV-DC細胞におけるIFN-γ誘導性CXCL10の発現は、mRNAレベルでも分泌タンパクレベルでも有意に抑制されることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ドライマウスの原因である唾液腺腺房構造の破壊に蛋白分解酵素Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) が有意に増加していることを発見し、その分子メカニズムをヒト唾液腺細胞株を用いて探索した。
ヒト唾液腺導管細胞株（NS-SV-DC）では、IFN-α,TNF-α,IL-1βの刺激によりMMP-9 mRNAの発現亢進を認め、IFN-γではMMP-9 mRNA発現に変化を認めなかった。次に、SS口唇腺において炎症性細胞浸潤に関与すると考えられるケモカインCXCL10とMMP-9の関連を調べた。研究代表者はすでにIFN-γがNS-SV-DC細胞においてCXCL10発現を誘導することを報告しており、導管細胞からのCXCL10分泌にMMP-9が関与しているのではないかと考えた。NS-SV-DC細胞にMMP-9阻害剤を加えることによりIFN-γ誘導性CXCL10の発現は、mRNAレベルでも分泌タンパクレベルでも有意に抑制されることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ドライマウス疾患モデルに対するMMP-9阻害薬の有効性と有害事象の評価を行う。加齢モデルマウス (C57BL/6CrSIc マウス) およびSS疾患モデルマウス（Tx-NFS/sld マウス）にMMP-9阻害薬 (Marimastat, British Biotechnology 社) とコントロールとして生食を週1回投与し、週1回唾液分泌量と体重の測定を行う。30週齢でマウスの唾液腺を摘出し、腺房構造およびリンパ球浸潤程度を病理組織学的に評価する。さらに唾液腺と血清を用いて免疫組織学的検討（各免疫細胞分画、機能解析、各種免疫関連分子の発現解析）を行い、MMP-9阻害薬のドライマウス治療薬としての有効性と有害事象を各モデルマウスごとに評価する。
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| Causes of Carryover |
ドライマウス患者におけるMMP-9関連遺伝子群の同定のため、加齢ドライマウス患者口唇腺とSSドライマウス患者口唇腺を用いてDNAマイクロアレイを行う予定であったが、加齢ドライマウス患者の口唇腺採取の同意が得られにくく、検体数が不足のため解析が行えなかったため次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費と合わせて、MMP-9発現を制御する遺伝子およびMMP-9により制御を受ける遺伝子を特定するためのDNAマイクロアレイ解析とGeneSpring GX (Agilent Technologies)とIngenuity Pathway Analysis (IPA)解析に使用する予定である。
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