歯牙エナメル質再生研究に関わるTGF-βアイソフォームの特異的作用の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18794
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 小林 冴子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (90804534)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: エナメル質 / 幼若エナメル質 / エナメル芽細胞 / 生理活性物質 / TGF-β

Outline of Annual Research Achievements

本研究は歯牙発生や形成において重要な役割を担う生理活性物質の一つであるTransforming growth factor-β(TGF-β)に注目し、エナメル質形成過程におけるTGF-βの役割と機能について解明することを目的とする。複雑なTGF-βの動態を理解することを通じ、歯牙硬組織形成のメカニズムの知見を得るとともに、新たな歯科再生医療技術の構築を目指すものである。
マウス切歯、臼歯またはブタ永久歯歯胚より得られた試料にて、TGF-βアイソフォーム毎の遺伝子発現、タンパク質定量および生理活性レベルの測定を行った。哺乳類で知られているTGF-β１，２，３がそれぞれ検出されたが、遺伝子発現時期、発現量およびタンパク質レベルでの定量や活性レベル測定には差があり、アイソフォーム毎に異なる様相を呈した。これまでの知見ではTGF-βは主にエナメルマトリック内を成熟化させる傾向が考えられてきた。本研究ではTGF-βのアポトーシス誘導の可能性についてcaspase-3モノクローナル抗体を用いた免疫染色による実験を行ったところ、全てのアイソフォームにコントロールと比較して優位な測定値を示したが、その分布はβ３が最も高く、ついでβ２、β１という結果となり、やはりアイソフォーム間においても有意な差を認めた。
これらのサイトカインはTGFBR1および２という受容体に結合して様々な生理作用を調整しているが、各アイソフォームで特異的な時期や異なる役割について証明するためには、エナメル芽細胞への影響やシグナル伝達領域での作用について、アイソフォーム毎のさらなる検証が必要である。
またTGF-β活性にはどのような調整機能が存在するのかを追求し、再生医療への応用に知見を得たい。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

コロナ禍での出勤調整や３密を回避した研究室の体制により、実験計画の再考を余儀なくされた。特に本年の前期では研究代表者の保育利用に制限がかかり研究のスタートに大幅な遅れが生じた。
新たなサンプリングは困難なため、研究室に保存してある過去の試料を出来得る限り活用しての検証となった。また細胞を用いた研究は通常の研究体制が回復する頃まで始めることが出来なかった。

Strategy for Future Research Activity

mHAT9d細胞を用いて、TGF-β活性の調整機構について検証を行う。具体的にはアメロゲニンの結合能での活性の差やエナメルプロテアーゼによる影響について実験する。
また各アイソフォームのシグナル伝達系について主にPCRを用いて解析を行う。主な経路はSMAD3/4であるが、多角的な解析のためサブ的な経路についても幅広い検証が必要と考える。

Causes of Carryover

コロナ禍による出勤制限等により、実験を開始する時期や実験の規模縮小が余儀なくされた。特に新たなサンプリングやコンスタントな細胞実験が行われなかったため、消耗品に使用する予算に大きな繰り越しが生じている。また、出張や学会参加は全て行われず、WEB開催となったため旅費にも繰り越しが生じた。
次年度助成金は繰越金と併せて、細胞実験および遺伝子解析のためのPCR検査に必要な抗体や消耗品に充てる。