病原性細菌の新規遺伝子型別法の提唱

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18923
• Research Institution: Toyama Institute of Health
• Principal Investigator: 安川 和志 富山県衛生研究所, 化学部, 主任研究員 (00737835)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 遺伝子型別 / 三重鎖DNA / 病原性細菌 / レジオネラ属菌 / ポリプリン配列

Outline of Annual Research Achievements

細菌感染による食中毒や感染症等の発生時には、「起因菌の同定」と共に「菌株の型別」を実施する必要がある。本研究は、微生物の染色体DNA上に存在するポリプリン-ポリピリミジン（PolyR）配列情報を利用した遺伝子型別方法論の確立と検査法への応用を目的としている。
令和2年度は、以下の実験を実施した。
1. レジオネラ属菌（163株）の他、黄色ブドウ球菌（189株）、カンピロバクター属菌 （120株）の染色体DNA情報から、連続する15または16塩基長のPolyR配列情報を抽出し、それぞれのデータベースを構築した。さらに、構築したデータベースから遺伝子型別に利用可能と考えた96種または48種のPolyR配列のデータセットを作成し、菌株識別能力を評価するためSimpson’s index (D index)をHunterとGastonの式に従って算出した。本遺伝子型別法は、既知の遺伝子型別法（例えばMulti locus sequence typing法を代表とする遺伝子配列の解析等）と比較して、菌株識別能力(D index)が高い結果を得た。
2. 開発した三重鎖DNA形成温度の予測式について、in vitroの実験系で機能していることを確認するため、温度変化に対する三重鎖DNA構造の状態変化を制限酵素切断アッセイ法により相関を求め、開発した予測式がin vitroの系で機能していることを確認した。
3. PolyR配列を対応する三重鎖DNA形成用モレキュラービーコンで検出するアッセイ系構築のために、三重鎖DNA構造を安定化させる化合物の検討を実施しPolyR配列情報との相関を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、PolyR配列を利用したレジオネラ属菌の遺伝子型別法の検討を実施し、Sequence-based typing法と比較して本遺伝子型別方法の菌株識別能力の優位性を確認した。次年度以降に検討予定であった、黄色ブドウ球菌とカンピロバクター属菌に関しても、染色体DNA配列上のPolyR配列を利用した遺伝子型別法を検討し、従来法と比較して菌株識別能力が優れていることを確認した。
独自開発した三重鎖DNA形成温度の予測式がin vitroの実験系で機能していることを確認した。
三重鎖DNA構造を安定化させる化合物の検討を実施した。
以上の点から、おおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

1. 三重鎖DNA形成温度の予測式を利用して、染色体DNA上に存在するPolyR配列を三重鎖DNAの形成によって検出が可能なモレキュラービーコンの設計を実施する。また、検出系の最適化を行い、反応の選択性と検出感度等の検討をする。
2. 病原性大腸菌や結核菌等の他の病原性細菌について染色体DNA上に存在するPolyR配列の解析を行いデータベースの構築をする。

Causes of Carryover

研究活動に必要な旅費や学会参加費を使用しなかった。また、設備備品費や消耗品費を節約できたため、次年度に資金を繰り越すことにした。
今後、三重鎖DNA形成領域の検出系構築のために必要な備品や消耗品の購入に活用する。