Effect of ApoE-HDL on lipid metabolism of astrocytes

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K19683
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 高橋 祐司 北海道医療大学, 医療技術学部, 講師 (60804292)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ApoE-HDL / 脳内脂質代謝 / アストロサイト / アルツハイマー / 老化

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ヒトの培養アストロサイトをApoE-HDLによって刺激を行い、細胞内脂質代謝にどのような変化が生じるのかを明らかするため、ApoE-HDLとApoA1-HDLを用いてヒト培養アストロサイトに対する比較実験を行うものである。１）脂質含量の異なるApoE-HDL刺激は、細胞内脂質代謝に影響を与えるのか２）アストロサイトからのコレステロール引抜き量は、ApoE-HDLとApoA1HDLで差があるのか３）酸化ApoE-HDLは、アストロサイトの生存率と細胞内脂質酸化に関与しているのかを明らかにすることを目的としている。
令和２年度は、健常人血液から分取したApoE/ApoA1-HDLの脂質含量変化が、ヒト培養アストロサイトの細胞内代謝にどのような影響をあたえるのか、コレステロールの引抜き量に差があるのかを確認するため、ApoE/ApoA1-HDL刺激後の細胞内変化の確認をしている。
また、血中のApoE-HDLは、エステル型と遊離型コレステロールの両方を細胞から引き抜くことができるが、ApoA1-HDLは遊離型しか細胞から引き抜くことができない点に着目し、アストロサイトからのコレステロール引抜き量にApoE-HDLとApoA1-HDLにどの程度の差が生じるのか確認するための実験系を構築中である。コレステロールを培養細胞に取り込ませた後、ApoE/ApoA1-HDLでそれぞれ刺激を行い、上清及び細胞のコレステロール量を、酵素法と質量分析計により解析する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒトApoE-HDLとApoA1-HDLの分手法はすでに確立しているが、分手法をより改良し、HDL自体の酸化を防ぐ方法を改良中であるため。また、培養アストロサイトへの負荷する際の至適濃度の最適化に時間がかかっているため、当初の計画よりやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

アストロサイト表面のレセプター別のApoE-HDL取り込み率を明らかにする。また、酸化ApoE-HDL取り込み経路と細胞障害を確認する。
１）ApoE-HDLの脂質含有量の変化と取り込みレセプターの確認
細胞表面のリポタンパク質レセプターのApoE-HDL取り込みを確認する。コレステロールを取り込んだ後のApoE-HDLは粒子径が変化し、リポタンパク質表面の特性が変化する可能性がある。アストロサイトが反応するApoE-HDL受容体は、LDL receptor, VLDL receptor, LDL receptor-related proteinの３種類が認められている。siRNAを用いたRNA干渉によりレセプターのノックダウンを行い、取り込み量の変化を確認する。
２）酸化ApoEを取り込んだ細胞の影響を解析
ApoE-HDL自身の酸化が、アストロサイトの生存率に影響するのか確認する。HDL自身に酸化が生じると、ラジカル連鎖反応を介し細胞へ障害を与える可能性がある。CuSO4で銅酸化を行い、酸化ApoE/ApoA1-HDLを作成、細胞刺激に用いる。刺激後の細胞内の脂質代謝関連遺伝子の確認、細胞毒性・生死判定をWST-1で行う。細胞内コレステロール、トリグリセリド、リン脂質中の脂肪酸ヒドロペルオキシドを質量分析計で確認する。

Causes of Carryover

情報収集のために計上していた国内学会・国際学会の参加旅費が感染症流行のために、中止・オンライン開催となったために余剰金として生じた。本年および来年度へ向けた国際学会への参加に活用したい。また、本年度より細胞培養が本格化することから培養液等の高コストの実験が控えており有効に活用する。