RNAポリメラーゼIIのDNA二本鎖切断修復機構への関与の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K19968
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 磯野 真由 名古屋大学, 環境医学研究所, 客員研究者 (90713511)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: RNAポリメラーゼ / DNA二本鎖切断

Outline of Annual Research Achievements

転写領域におけるRNAポリメラーゼ(Pol II)の停滞やRNA:DNAハイブリッド構造の蓄積はゲノムの不安定性を誘発し、発がんや難治性神経変性疾患につながることを示唆する報告がある。ゲノムの不安定化はDNA損傷応答・修復機構に障害があると誘発される。また、Pol IIが内因性のDNA二本鎖切断(DSB)の誘発に寄与することは示されている。しかしながら、転写領域のDSB修復の分子機構の詳細は明らかにされていない。Pol IIのDSB修復経路への関与と役割について明らかにすることによって、上記で示すような病態解明の一助になると考えている。
カンプトテシンによってDSBが誘発されている状況下で、Pol II抗体による免疫沈降法を用いたウェスタンブロットを行い、DSB修復関連タンパクの抗体を用いたスクリーニングから、いくつかのタンパクがPol IIと相互作用することを確認した。その中の相同組換え修復関連タンパクの一つ(名前は伏せる)に注目して実験を行い、SUMO認識型ユビキチンE3リガーゼ(名前は伏せる)の欠損によって、Pol IIとの相互作用が見られなくなることを確認した。
今後は、Pol IIとDSB修復関連タンパクの相互作用やSUMO認識型ユビキチンリガーゼがDSB修復にどのような役割を持つのか詳細を検討したいと考えている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

DSBの誘発については、制限酵素の発現誘導によって細胞内の任意の部位にDSBを誘発させるシステムを組み込んだ細胞株の樹立を当初試みたが、ベクター作成が難航したため、カンプトテシン処理を用いた。免疫沈降法を用いたスクリーニングの結果からPol IIと数種類のDSB修復関連タンパクとの相互作用があることを確認できたのは大きな進歩である。また、SUMO認識型ユビキチンE3リガーゼ欠損細胞株を複数樹立するために時間を要したが、Pol IIとDSB修復関連タンパクの相互作用に寄与していることを示す事ができた。また、カンプトテシン処理によってPol IIのユビキチン化が起こる事は確認したが、SUMO化については検討が不十分である。令和3年度は、研究代表者が体調不良による療養が必要であったため、思うように研究を進めることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

先ずは下記２点の実験を優先する。
①DSB損傷に伴うPol IIとDSB修復関連タンパクの相互作用が、DSB修復に寄与するのか、gH2AXやRPAなどのfociをカウントし、修復欠損等が見られるかを検討する。
②DSB損傷に伴うPol IIのユビキチン化やSUMO化の有無について明らかにし、SUMO認識型ユビキチンE3リガーゼがPol IIと直接的に関与している可能性があるのかを検討する。
その後は、上記細胞レベルでの検討の他、マウスを用いた表現系による評価も行い、転写領域におけるDSB修復機構と病態との関係性を明らかにして行きたいと考えている。

Causes of Carryover

研究代表者が体調不良による療養が必要であったため、思うように研究を進めることができなかった。
使用計画としては、令和３年度に実施する事ができなかった下記２点に関する実験に充てたい。
①DSB損傷に伴うPol IIとDSB修復関連タンパクの相互作用が、DSB修復に寄与するのか、gH2AXやRPAなどのfociをカウントし、修復欠損等が見られるかを検討する。②DSB損傷に伴うPol IIのユビキチン化やSUMO化の有無について明らかにし、SUMO認識型ユビキチンE3リガーゼがPol IIと直接的に関与している可能性があるのかを検討する。