2021 Fiscal Year Research-status Report
放射線が誘発する細胞内温度、pH変化とそのダイナミクスの解明
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20K19969
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| Research Institution | National Institutes for Quantum Science and Technology |
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Principal Investigator |
神長 輝一 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 研究員 (90825176)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞内温度 / 蛍光ナノダイヤモンド / DNA損傷修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は細胞内オルガネラへのナノダイヤモンドデリバリー技術の研究開発を行った。表面をカルボキシル基で修飾したナノダイヤモンドは培地添加によりエンドサイトーシスにて細胞内に取り込まれる。しかしながら、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれたナノダイヤモンドはエンドソーム、リソソームから離脱することが稀であり、また細胞核内に侵入するためには核膜孔を通過する必要があるが、核膜孔の大きさは50nm以下とされている。そこで本年度は複数サイズのナノダイヤモンドを親水化修飾によりナノダイヤモンド同士の凝集を抑制と、核シグナルペプチドを付加することでエンドソームから確率的に抜け出したナノダイヤモンドが細胞核内に移行できるか検討を行った。
まず、親水化修飾の効果について検討を行った。グリシドールを樹状に分岐させる超分岐ポリグリシドールによる親水化修飾を行った結果、水中のみならず150mM程度の塩が存在するPBS中においてもナノダイヤモンド同士の凝集を抑制できること動的光散乱法を用いた粒子径解析により確認した。
さらに、親水化修飾を行った複数粒子径（200~50nm）のナノダイヤモンドに核移行シグナルペプチドを付加し、核への局在性を評価した。その結果、200nmのナノダイヤモンドに核移行シグナルペプチドを付加した場合には核移行が観察されなかったが、50nmのナノダイヤモンドに核移行シグナルペプチドを付加した場合には一部のナノダイヤモンドが核内に存在すると思われる結果を得ることができた。これはエンドソームを抜け出した核移行シグナルペプチド付加ナノダイヤモンドが核移行を果たしたものと考えられるが、一方で大多数のナノダイヤモンドは細胞質に存在していたことから、更なる核移行を実現するためには高効率にエンドソームを抜け出すシステムをナノダイヤモンドに修飾する必要があると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画では1~2年目に任意の細胞内ターゲットに蛍光ナノダイヤモンドを送達する技術を開発する予定であったが、新型コロナウイルス感染症流行に伴う緊急事態宣言、蔓延防止等感染対策により在宅勤務を余儀なくされたため、送達技術の開発に遅延が生じている。一方で、これまでに放射線照射前後で細胞内温度に差異があることを示す結果を得られていることから、遅延の程度は軽微であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前半は任意細胞内ターゲットへの蛍光ナノダイヤモンド送達技術の開発を進める。具体的には細胞核内、およびミトコンドリアへのターゲティング手法を開発し、送達メカニズムとしては細胞核局在シグナルペプチドおよびミトコンドリア局在シグナルペプチドを用いる予定である。また、細胞内にてシグナルペプチドを機能させるためにはエンドサイトーシスによる取込経路を用いることが困難なため、脂質二重層を用いた膜融合によりシグナルペプチドを付加した蛍光ナノダイヤモンドを細胞内に導入する手法を開発する。
後半は前半で開発した細胞核あるいはミトコンドリア局在性蛍光ナノダイヤモンドを用いて、放射線照射後の温度およびpH変化を明らかにする。さらに、薬剤によりDNA損傷修復の阻害や修復経路の制限を行い、温度およびpH変化に対するDNA損傷応答の寄与修復経路依存性の解明を試みる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の蔓延が持続したため、当初予定していた学会参加の機会が減少し旅費の支出が減少した。消耗品の購入により研究を進めたが差額が生じた。次年度は学会に参加し研究発表や情報収集を行う。
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Research Products
(4 results)
